Nature Communications：pH敏感探针研讨中取得停顿

囊泡胞吐作用是一个疾速的动静进程，通过节制囊泡包裹的活性肽或神经递质向细胞内部开释，从而调理紧张的心理功效。今朝对囊泡胞吐的检测技术次要包含电心理和光学成像的办法。基于膜片钳的电心理检测技术可以对单个细胞的胞吐变乱进行检测，该技术的次要劣势是操作的光阴分辩率高，可在毫秒标准上检测单个细胞中囊泡的胞吐变乱。然而，电心理检测技术次要用于离体单个细胞或脑片中单个细胞的检测，较难完成多个细胞的同时检测及在体监测。另外，膜片钳技术检测的是单个细胞中多个囊泡胞吐的表观变乱，无奈对单个囊泡的锚定和交融进程进行察看和检测。而基于光学成像的检测技术可以同时对多个细胞中的囊泡胞吐变乱进行追踪和记载，该技术还可以对单个囊泡的胞吐变乱进行检测，这关于在分子程度提醒囊泡与质膜锚定、交融的调控机理非常紧张。在此进程中，荧光卵白交融标志为显微成像提供了无力对象。与可透膜的荧光染料相比，荧光卵白成像配景低、信噪比高、生物毒性低、表白量可控，是活细胞成像的首选。

成熟的囊泡腔内为酸性pH情况（pH约为5.6）。囊泡胞吐时，囊泡膜与质膜产生交融，腔内pH刹时切换为偏碱性的细胞外情况（pH约为7.4）。基于此个性，迷信家通过氨基酸渐变及挑选，终极得到pH敏感型GFP渐变体pHluorin，今朝已被普遍用于检测突触囊泡、排泄小泡和再轮回内体的胞吐作用。然而，因为产生膜交融前，位于质膜邻近囊泡内的pHluorin荧光旌旗灯号弱，限定了其追踪囊泡锚定步调的利用。此外，现有的赤色pH敏感荧光卵白探针与pHluorin相比，pH敏理性相差甚远。此中，pHuji的性子绝对较好，但该卵白荧光强度低且具备疾速的荧光衰减个性，其荧光强度在 2s的间断照明下即降到初始荧光的35%，不得当囊泡排泄检测和能源学跟踪。

中国迷信院生物物理研讨所研讨员徐平勇课题组在Nature Communications上，颁发了题为pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps的研讨文章。该研讨开辟出一个亮度高、稳定性好、pH敏理性强的赤色荧光卵白探针pHmScarlet。该探针在现有赤色荧光卵白中具备最高的pH敏理性，能检测到更多的排泄变乱，而且可同时可视化排泄变乱中的囊泡锚定和交融步调。在用于囊泡排泄变乱检测时，pHmScarlet具备与绿色pH敏感荧光卵白pHluorin媲美的排泄旌旗灯号。此外，pHmScarlet还具备pHluorin不具有的检测才能。pHmScarlet的pKa值使得其在酸性前提下可检测完全囊泡中的荧光强度，完成对囊泡锚定步调的追踪和记载。该探针还可以与pHluorin联合，对多个囊泡卵白进行双色成像（如图（a-c））。此外，虽然pHmScarlet的发射波长与pHluorin相比显明红移，但其空间分辩率足够高，可以使用Hessian构造光照显明微镜（Hessian-SIM）进行超高分辩率成像，解析出囊泡交融孔的环形构造（如图（d-f））。可以预测，该pH敏感赤色荧光卵白探针将在囊泡排泄与运输畛域有更普遍的利用。(100yiyao.com）