Cell子刊：颠末化学修饰的gRNA可将CRISPR

2021年8月11日讯/BIOON/---在一项新的研讨中，美国纽约年夜学和纽约基因组中间的Neville Sanjana博士及其团队为靶向RNA而不是DNA的CRISPR体系开辟出颠末化学修饰的导游RNA（gRNA），这是拓展基因修饰及其表白程度的最新尽力。这些颠末化学修饰的gRNA极年夜地加强了在人类细胞脱靶向---追踪、编纂和/或敲降（knockdown）---RNA的才能。相关研讨成果于2021年8月2日在线颁发在Cell Chemical Biology期刊上，论文题目为“Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas13 knockdown in human cells”。

在这项新的研讨中，这些作者摸索了一系列分歧的颠末修饰的gRNA，并具体阐明了相比于未颠末化学修饰的gRNA，颠末化学修饰的gRNA若何将CRISPR-Cas13体系的靶向效率进步2至5倍。他们还发现，优化的化学修饰将CRISPR-Cas13的靶向活性从48小时缩短到4天。他们与来自Synthego公司和新英格兰生物试验室（New England BioLabs）的迷信家们单干，造成了一个具备酶纯化和RNA化学业余常识的多样化研讨团队。为了利用这些优化的化学修饰，他们靶素来自安康供者的人类T细胞中的细胞外表受体和RNA病毒SARS-CoV-2的一切已知变体都具备的基因序列的“通用”片断。

进步CRISPR-Cas13靶向的效率和“寿命”对迷信家们和药物开辟者具备症结代价，可以许可更好地敲降基因，并有更多光阴研讨遭到敲降的基因若何影响相关通路中的其他基因。

论文独特第一作者、Sanjana试验室博士后研讨员Alejandro Méndez-Mancilla说，“CRISPR体系中的gRNA递送能够具备挑战性，这是由于gRNA会疾速降解，基因蒙受敲降的光阴遭到限定。咱们遭到了针对其他靶向DNA的CRISPR体系进行的gRNA修饰的启迪，想要测试颠末化学修饰的gRNA是否可能改恶人类细胞脱靶向RNA的CRISPR-Cas13的敲降光阴。”

Sanjana试验室之前的研讨概述了针对CRISPR-Cas13的最佳gRNA设计准绳，并于2020年3月颁发在Nature Biotechnology期刊上（Nature Biotechnology, 2021, doi:10.1038/s41587-020-0456-9）。在此根底上，这些作者在这项新的研讨中体系地利用和测试了多种化学修饰。例如，他们发现，在人类细胞系中，在gRNA中增加三个用分歧类型的化学键互相连贯的碱基（硫代磷酸修饰）对RNA靶标的敲降才能缩短了数天。在原代T细胞中，这种硫代磷酸修饰将CD46（一种参加免疫体系调理的受体）的表白敲降了60%～65%，而在使用未颠末修饰的gRNA时仅将CD46表白敲降了40%～45%。

这些作者还发现，某些甲基化和反向终止修饰（inverted terminator modification）也能进步Cas13的活性。关于一切的化学修饰而言，遭到修饰的RNA碱基地点的地位也很症结。当搁置不正确时，这些修饰招致gRNA不克不及发扬作用。论文独特第一作者、Sanjana试验室博士后研讨员Hans-Hermann Wessels说，“咱们愿望这些针对CRISPR-Cas13的颠末化学修饰的gRNA的无效性和稳定性的进步将有助于为靶向RNA的CRISPR酶在原代细胞中的使用摊平路途。”

Sanjana说，“这些颠末化学修饰的gRNA进一步扩展了基因组和转录组工程的对象箱。关于人类基因组中的非编码序列元件，靶向DNA能够并不那么无效，而其他微生物，如冠状病毒或流感病毒等RNA病毒，基本无奈应用现有的技术加以靶向。”

图片来自Cell Chemical Biology, 2021, doi:10.1016/j.chembiol.2021.07.011。

例如，这些作者在人类细胞中测试了敲除RNA病毒SARS-CoV-2的通用领导序列片断，发现只有使用像Cas13如许的靶向RNA的CRISPR酶能力完成。SARS-CoV-2进入细胞并开释其RNA基因组，然后被转录成更小的RNA，即亚基因组RNA。这些亚基因组RNA担任制作这种病毒复制所需的分歧卵白质，然后感化其他细胞。这种通用领导序列在每个亚基因组RNA的结尾被发现。是以，一种无效靶向这种通用领导序列的办法能够会维护细胞免受这种病毒的进一步复制和感化。

异样紧张的是，CRISPR-Cas13可能在不永恒性改动DNA基因组序列的环境下调控基因表白，相反像Cas9或Cas12a如许的靶向DNA的CRISPR酶可能永恒性改动DNA基因组序列。Sanjana指出，“在生物医学研讨和药物开辟中，通常倾向于采取瞬时调理来刺激基因表白。例如，针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗是瞬时表白的，但会发生一种免疫影象，这种免疫影象的继续光阴超过mRNA的表白寿命。”（100医药网 100yiyao.com）