TiBS：颁发对于cryo

起源：清华年夜学 2021-09-14 08:38

囊膜病毒门类泛滥，此中不乏污名昭着之辈，例如埃博拉病毒（Ebola），艾滋病病毒（HIV），流感病毒（influenza），以及新冠病毒等（SARS-CoV-2 virus）。研讨其构造、入侵机制以及性命周期是针对性开辟疫苗、抗体以及药物的根底，始终是构造生物学热门。但囊膜病毒的多态性给传统构造生物学伎俩带来不少费事，其较小的尺寸（直径~100nm）也给在细胞内间接察看这些病毒的性命运动带来了挑战（图1）。回想过来20年来，cryo-ET技术与构造病毒学协同倒退，互相匆匆进：为在动静组装、多形的囊膜病毒上间接解析高分辩卵白构造，分子cryo-ET偏向向高通量、高分辩偏向倒退；为一窥病毒在细胞中的性命运动，细胞cryo-ET偏向新型特同性生物标志、冷冻光电结合成像（cryo-CLEM）、冷冻聚焦离子束减薄（cryo-FIB milling）等偏向倒退。2020年，cryo-ET为全面展现新冠病毒完全构造、组装纪律、病变细胞构造等方面做出了杰出的奉献，已在顶尖刊物颁发多篇文章，此中包含2020年9月李赛试验室解析的完全新冠病毒三维构造。这些任务不仅为病毒学、疫苗、抗体研讨提供了高分辩构造信息，也为科普、防疫等带来年夜量真实精确的影像资料。

清华年夜学性命迷信学院李赛副传授应邀在国内出名学术期刊Trends in Biochemical Sciences的冷冻电镜特刊颁发题为《囊膜病毒研讨中的冷冻电镜断层成像技术》（Cryo-electron tomography of enveloped viruses）的综述文章，体系总结了cryo-ET在解析囊膜病毒构造，提醒其组装和性命周期机制等研讨中的利用。文章也体系总结了近年来cryo-ET技术在各方面的提升及利用范畴的扩大，并对畛域将来进行了瞻望。

发达倒退的cryo-ET技术及原位构造生物学

原位构造生物学的目的是将超年夜卵白质机械从生物膜、病毒、细胞、乃至组织情况中间接解析，以得到其在体构造、与核酸/生物膜的互作关系及散布信息。原位构造生物学焦点技术是cryo-ET：它是将置于透射电镜样品台上的冷冻样品沿固定轴扭转，并从多个角度摄影得到倾转系列（tilt series， TS），将其重构为三维断层图像，再使用子断层均匀法（sub-tomogram averaging， STA）进行构造解析的新型构造生物学办法。过来10年，为解决分歧标准的构造生物学识题，cryo-ET畛域也开辟出一系列样品制备、卵白定位、数据阐发等配套技术，它们包含：疾速投入式冷冻制样、低压冷冻制样、冷冻光电结合成像（cryo-CLEM）、电镜可见的特同性生物标志、冷冻聚焦离子束减薄（cryo-FIB milling）、相位板（VPP）、基于人工智能的图像辨认、降噪和图形联系等。现今，cryo-ET不再仅指采集倾转系列数据的办法，而成为一种包纳上述多种前沿技术的自力的构造生物学偏向。

相比传统的冷冻电镜办法，cryo-ET的原始数据添加了准确的Z轴信息，是以对样品纯度及组装严厉性要求较低，且在制备样品进程中无需使其脱离原生情况，得到的构造更具心理意义。跟着它的日益欠缺，从病毒到、细胞乃至组织维度间的构造生物学空缺将获得填补（图2）。

Cryo-ET解析卵白质复合物高分辩构造必要搜集含无数万个目的复合物的照片，是以，在细胞等原位情况中高效的寻觅目的复合物是原位构造生物学的条件。然而，卵白质复合物、病毒与细胞、组织之间存在微小的尺寸差别，并且细胞外部情况极为拥堵、喧闹，这给寻觅目的复合物带来了微小挑战。举例阐明，因为尺寸比例近似，在细胞中找到一颗病毒的难度好比在黄昏时全是人群的足球场找到一颗足球。是以，仅使用冷冻电镜在细胞中“试试看”式的寻觅目的复合物将极为低效。今朝有多种方案解决这个成绩，目的均是在细胞中完成单分子的定位精度，它们可分为两类：1）新型特同性生物标志；2）CLEM将光学显微镜与电镜联系关系。

Cryo-ET是提醒囊膜病毒构造、膜交融进程的利器

李赛在综述中体系论述了cryo-ET和STA若何作为囊膜病毒研讨的无力对象。Cryo-ET技术不仅能重构病毒的完全构造组装（图1），还可提供构成病毒的各种构造卵白的原位高分辩构造，如糖卵白、基质卵白等。此中病毒外表糖卵白是病毒入侵细胞的症结分子、免疫进攻的紧张靶标，因而在构造卵白研讨中最受存眷。Cryo-ET技术则提供了无关糖卵白的多维度原位构造信息。例如，cryo-ET发现新冠病毒外表刺突卵白可在病毒外表以一个较年夜的角度进行摆动；又如，丙型流感病毒外表糖卵白HEF会在原位造成六聚的高聚构造，使得在原位上，HEF卵白的头部比晶体构造中有更多的扭转和扩展（图3）。这些原位构造的解析为疫苗、抗体的研发提供了病毒在人造状态下的更多细节。

同时，文章翔实归结了cryo-ET技术是若何奉献于体外模拟膜交融、及交融进程中糖卵白构象变动的相关研讨。例如，传统的构造研讨办法限定了糖卵白不克不及处于原位的膜情况、从而下降相识析膜交融进程的靠得住性，而cryo-ET技术恰恰补充了这一缺憾。李赛曾应用酸化孵育前提诱导裂谷热病毒糖卵白产生构象变动、介导与脂质体产生膜交融，并运用cryo-ET技术胜利在孵育30秒的光阴点捕获并解析了裂谷热病毒糖卵白变构拔出脂质体的中心构造。由此可以窥见cryo-ET技术使得更多简单体外前提的构造解析变为能够，展示了宽广的利用场景。