Cell：告别“猜谜式”诊断！临床意义未明变异（VUS）研究新范式，系统性破解遗传病变异解读难题

基因迷宫中的 未知之声 ：当测序结果带来更多困惑

想象一下，你正在校对一部数百万字的巨著，偶尔发现一个错别字。你该如何判断这个错字是无伤大雅，还是会彻底改变整个句子的意思？这就是现代基因诊断面临的现实挑战。

NGS技术让我们能够高效地检测出个体基因组中的变异位点，但其中绝大多数都是VUS。传统的做法是 一事一议 ，针对每个VUS进行繁琐的实验室验证，或者等待在更多患者身上发现同样的变异，并观察他们是否有一致的临床表现。这个过程极其缓慢，往往耗时数年，对于急需治疗的患者来说，每一天都是煎熬。

研究人员将目光投向了先天性免疫缺陷(IEI)。这类疾病通常由单个基因的 功能获得 (gain-of-function, GOF)或 功能丧失 (loss-of-function, LOF)突变引起，致病机理相对明确，是检验新技术能力的理想 试验场 。

他们选择的具体 案例 是活化PI3K 综合征(APDS)，一种典型的IEI。患者的免疫系统过度活跃，常常表现为反复的、淋巴结肿大、自身免疫病，甚至。这种疾病的 罪魁祸首 是编码磷脂酰肌醇-3-激酶 (phosphoinositide 3-kinase , PI3K )的两个基因 PIK3CD或PIK3R1 发生了GOF突变。

PI3K 是免疫细胞（尤其是T细胞）中的一个关键信号分子，像一个油门，控制着细胞的活化、增殖和分化。正常情况下，这个 油门 受到精确调控，踩得恰到好处。但在APDS患者体内，由于基因突变，这个 油门 被卡住了，导致信号通路持续 轰鸣 ，免疫细胞变得异常兴奋，从而引发一系列免疫失调。

然而，即便是在APDS这个相对明确的疾病中，医生们也只对少数几个已知的致病突变有把握。当在患者的PIK3CD或PIK3R1基因上发现一个新的、从未报道过的VUS时，诊断和治疗的决策便再次陷入僵局。要打破这个僵局，就需要一把能够快速、准确地判断任何一个VUS是 油门踩死 (GOF)、 油门失灵 (LOF)还是 无影响 的 万能钥匙 。这正是该研究的核心任务。

铸造 变异分类器 ：一把能同时称量数千个基因 错字 的天平

面对成千上万个潜在的VUS，逐一验证无异于大海捞针。研究人员需要的是一个高通量的解决方案，一个能同时 称量 数千个基因 错字 功能效应的 天平 。他们巧妙地将两项前沿技术结合起来，构建了这个强大的 变异分类器 。

第一件法宝：基因 铅笔 碱基编辑器

传统的CRISPR-Cas9技术像一把 基因剪刀 ，通过切断DNA双链来进行编辑。但对于只需要修改单个碱基的VUS来说， 剪刀 显得过于 暴力 ，且修复过程可能引入新的错误。研究人员选择了更为精巧的工具 腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor, ABE)。它不像剪刀，更像一支神奇的 基因铅笔 ，可以在不切断DNA双链的情况下，直接将DNA中的一个碱基A（腺嘌呤）精确地修改为G（鸟嘌呤）。这种 无痕 编辑的方式，完美契合了模拟和研究单点突变的需求。

第二件法宝：高通量筛选的 导航系统

为了将这支 铅笔 引导到基因组的特定位置，需要一个 导航员 向导RNA(single-guide RNA, sgRNA)。研究人员设计了一个巨大的sgRNA文库，这个文库包含了数千种不同的sgRNA，每一种都像一个精确的GPS坐标，能够将ABE 铅笔 引导到PIK3CD或PIK3R1基因的不同位置，进行A-to-G的修改，从而在细胞内原位生成大量的、不同的基因变异。这个文库的设计极其周密，覆盖了这两个基因74%和69%的氨基酸残基，理论上可以生成成千上万种不同的蛋白质变体。

称量 砝码 ：一个与临床息息相关的细胞功能读数

有了工具和导航系统，还需要一个灵敏的 天平 来称量每个变异的功能后果。研究人员选择了一个极其巧妙的读数 T细胞中AKT和S6蛋白的磷酸化水平(pAKT/pS6)。AKT和S6是PI3K 信号通路下游的关键分子，它们的磷酸化水平直接反映了PI3K 这个 油门 踩下的深度。GOF突变会导致pAKT/pS6水平飙升，而LOF突变则会使其降低。更重要的是，这个指标已经被临床用于辅助诊断APDS，是一个久经考验、与疾病直接相关的生物标志物。

研究人员首先在健康人T细胞中验证了这个 天平 的灵敏度。他们用ABE分别制造了已知的APDS致病GOF突变(p.C416R)和已知的LOF突变(p.S281P)。结果令人振奋：与正常细胞相比，携带GOF突变的细胞在受刺激后，其高pAKT/pS6信号的细胞比例增加了12倍；而与携带LOF突变的细胞相比，这一比例更是惊人地增加了136倍！这个巨大的动态范围意味着，这台 天平 极其灵敏，足以分辨出从最强的GOF到最强的LOF之间的细微差别。

筛选流程：让细胞自己 投票

万事俱备，一场大规模的细胞功能筛选开始了。研究人员将sgRNA文库通过慢病毒载体导入健康人来源的原代T细胞中，然后通过电技术将ABE 铅笔 的信使RNA(mRNA)送入细胞。这样，成千上万的T细胞就被 编辑 成了携带各种PIK3CD或PIK3R1变异的 化身 。接下来，他们模拟了免疫激活的过程，刺激这些T细胞，然后使用流式细胞分选技术(FACS) 一个可以根据细胞表面或内部的荧光标记来分离细胞的强大工具 进行分选。他们设定了两个 投票箱 ：一个 极度活跃 箱（pAKT/pS6信号最强的前15%细胞）和一个 极度沉寂 箱（pAKT/pS6信号最弱的后15%细胞）。分选完成后，研究人员分别提取这两个 投票箱 里细胞的DNA，通过高通量测序来分析哪种sgRNA（即哪种基因变异）在其中富集了。逻辑很简单：如果一个变异导致了GOF，它就会被大量 投票 进入 极度活跃 箱；反之，如果导致LOF，则落入 极度沉寂 箱。通过这种巧妙的设计，研究人员将一个复杂的生物学问题，转化成了一个清晰的、可量化的 富集游戏 。

从混沌到有序：一张前所未有的基因功能地图

当测序数据汇集而来，一幅前所未有的基因功能地图逐渐清晰。这张地图不仅精确地标记了已知的 地标 ，更揭示了大量未知的 新大陆 。

地图的精准度：经得起考验

首先，研究人员检验了这套系统的准确性。结果堪称完美：所有已知的、明确致病的APDS相关的GOF突变，如PIK3CD的p.C416R和PIK3R1的p.L573P，都在 极度活跃 箱中表现出极强的富集。在数据库(ClinVar)中记录的11个致病或可能致病的变异中，有10个被他们的系统成功识别为显著的GOF。而33个已知的良性变异，则无一被错误地归类。基于这些已知变异的 金标准 数据，研究人员计算出其筛选方法的 致病性几率评分 (OddsPath)，对致病变异的评分为26.0，远超临床认可的 强证据 标准。这证明了，他们的系统不仅能 看 到变异，更能 理解 变异。

新大陆的发现：点亮百余个 未知 变异

这张地图最大的价值在于照亮了 未知 。研究人员成功地为超过100个之前被标记为VUS或从未被注释过的变异，提供了明确的功能分类。这些新发现的GOF和LOF变异，像一颗颗新星，点缀在PIK3CD和PIK3R1的蛋白结构上。例如，他们在PIK3CD的多个功能域中都发现了新的GOF变异，包括在适配器结合域(ABD)的p.Q80R、C2结构域的p.N334G以及催化域的p.H940R等。同样，在PIK3R1中，他们也发现了跨越不同结构域的新功能变异。这些发现极大地扩展了我们对APDS致病突变的认知谱。

超越一维视角：三维结构揭示 功能热点

研究人员并未止步于一份线性的变异列表。他们将这些功能数据叠加到PI3K 复合物的三维蛋白质晶体结构上，这一步带来了令人惊叹的洞见。从一维的基因序列上看，一些功能相关的变异可能相距甚远，甚至位于不同的蛋白质亚基上。但当它们被放置在三维空间中时，研究人员发现它们常常在空间上彼此靠近，形成所谓的 功能热点 。例如，PIK3CD上的GOF突变p.C416R与PIK3R1上的GOF突变p.K567G和p.L570P，虽然属于两个不同的蛋白，但在三维结构中却紧密相邻，共同位于两个蛋白的相互作用界面上。这表明，这些区域对于维持PI3K 的正常功能至关重要，任何微小的扰动都可能打破精密的平衡。这种三维视角为理解变异如何影响蛋白质功能提供了直观而深刻的生化证据。

选择最佳 标尺 ：为何pAKT/pS6优于细胞增殖？

在科学研究中，选择正确的测量指标至关重要。一些研究可能会使用细胞增殖或存活作为读数。研究人员也进行了对比，他们发现，虽然PI3K 信号也影响T细胞增殖，但使用增殖作为读数，其信噪比远低于pAKT/pS6。数据显示，pAKT/pS6筛选能够识别出25.3%的sgRNA具有显著功能，而增殖筛选只能识别出15.9%。更重要的是，一些已知的致病GOF突变，如PIK3CD的p.E1025G，在增殖筛选中完全 隐身 ，但在pAKT/pS6筛选中则清晰可见。这证明了选择一个与通路活性直接相关的、灵敏的读数是多么关键，它决定了我们能否捕捉到所有重要的生物学信号，尤其是那些效应较为温和但同样具有临床意义的变异。

细胞的 模仿秀 ：工程细胞如何揭示疾病真相与药物的秘密

破译了基因密码的含义只是第一步，更重要的是理解它如何影响疾病的发生，以及如何指导治疗。研究人员利用他们精确编辑的T细胞，上演了一场精彩的 模仿秀 ，完美复刻了APDS患者体内的病理状态和对药物的反应。

复刻疾病表型：T细胞的 衰竭 状态

在之前的研究中，人们发现APDS患者的T细胞表现出一种 细胞衰竭 (cellular exhaustion)的状态。这些细胞表面布满了抑制性受体，如PD-1和CTLA-4，内部则高表达衰竭相关的转录因子TOX，而维持T细胞 干性 和记忆能力的关键转录因子TCF1则显著下调。这使得患者的免疫系统虽然看似 过度活跃 ，实则 外强中干 ，无法有效清除感染。研究人员在他们工程改造的T细胞中也观察到了完全相同的现象。携带GOF变异的T细胞，其PD-1、CTLA-4和TOX水平显著升高，而TCF1水平则降低。这证明了他们构建的细胞模型能够忠实地模拟疾病的核心病理生物学特征。

药物测试：Leniolisib的敏感与抵抗之谜

Leniolisib是批准的全球首个专门用于治疗APDS的靶向药物，它是一种选择性的PI3K 抑制剂，能够直接作用于过度活跃的信号 油门 。研究人员用Leniolisib处理了他们携带各种GOF变异的工程T细胞。结果显示，绝大多数GOF变异都对Leniolisib高度敏感。用药后，飙升的pAKT/pS6信号被有效抑制，T细胞的 衰竭 表型也得到了逆转。

然而，一个意外的发现浮出水面。研究人员注意到，在PIK3R1基因的一个特定区域 SH2间结构域(inter-SH2, iSH2) 内的一簇GOF变异，包括p.K567G、p.L570P和p.L573P，表现出了部分耐药性。尽管Leniolisib能够降低它们的pAKT信号，但在pS6信号的抑制上效果较差，并且这些细胞在用药后仍然保留了相对较高的衰竭标志物水平。这个发现具有重大的临床意义。它首次揭示了不同APDS致病突变之间可能存在药物敏感性的差异，并精准地定位了耐药相关的 热点区域 。这意味着，携带iSH2结构域变异的患者，可能对Leniolisib单药治疗的反应不如其他患者。

来自真实世界的验证：患者样本的最终确认

为了验证上述发现，研究人员获得了两位真实APDS患者的T细胞样本，他们的基因型恰好为这一假说提供了绝佳的验证机会：患者1携带PIK3CD的GOF突变(p.E1021K)，属于Leniolisib敏感类型；患者2携带PIK3R1的GOF突变(p.N564K)，该突变正位于预测的耐药热点iSH2结构域内。实验结果与预测惊人地一致。两位患者的T细胞都表现出与工程细胞相同的信号亢进和衰竭表型。在使用Leniolisib治疗后，患者1的T细胞功能得到了很好的恢复。然而，患者2的T细胞，在PD-1和CTLA-4等衰竭标志物的抑制上，效果明显弱于患者1。这一来自真实世界的直接证据，强有力地证实了他们基于高通量筛选和工程细胞模型得出的预测：不同基因型的APDS患者，对的反应可能存在差异。

破解耐药密码，重塑 罕见 定义

发现了部分耐药性，研究的脚步并未停止。他们继续探索如何克服这一挑战，并着手回答一个更大胆的问题：APDS，这个被认为是百万分之几发病率的，真的有那么罕见吗？

联合疗法的 组合拳 ：克服耐药性的新策略

既然Leniolisib单药对iSH2变异的效果打了折扣，那么 组合拳 是否会更有效？研究人员将目光投向了PI3K 信号通路的下游。mTOR是PI3K 通路下游的一个核心激酶，控制着细胞的生长和代谢。既然Leniolisib抑制 上游 不够彻底，那么同时用另一种药物抑制 下游 的mTOR，是否能实现更完全的通路阻断？他们测试了Leniolisib与两种mTOR抑制剂 雷帕霉素(rapamycin)或依维莫司(everolimus) 的组合。结果非常成功。在携带耐药性PIK3R1变异的工程细胞和患者2的T细胞中，联合用药相比于单用Leniolisib，能够更强效地抑制pS6信号，更彻底地逆转T细胞的衰竭表型，将细胞功能恢复到接近正常的水平。这不仅为潜在的耐药患者提供了一个合理的、有数据支持的备选治疗策略，也再次凸显了这种功能基因组学方法在指导新药组合开发方面的价值。

重新审视 罕见 ：在人群数据库中寻找 失落的病例

研究的最后一个篇章，也是最令人震惊的部分，是关于APDS患病率的重新评估。凭借手中这份详尽的、经过功能验证的GOF变异列表，研究人员得以在大型人群基因组数据库中进行精确的搜索。他们查询了多个数据库，包括一个8,453名疑似IEI患者的队列，以及一个包含超过63万普通人的 我们所有人 (All of Us)研究计划数据库。结果令人瞠目：在IEI队列中，他们发现了27名患者携带他们新发现的GOF变异；在 我们所有人 普通人群数据库中，他们找到了123名GOF变异的携带者。进一步分析发现，这些携带者患上各种免疫介导疾病的风险显著高于非携带者。这些数据强有力地表明，许多之前被忽视的VUS实际上是具有致病潜力的GOF变异，它们在人群中的存在远比想象的要普遍。

基于这些发现，研究人员做出了一个大胆的估算：在人群中，携带潜在致病性PIK3CD/PIK3R1GOF变异的频率可能高达1/5000！这个数字，比之前公认的1-2/百万的患病率，高出了一到两个数量级。这意味着，APDS可能根本不是一个极端罕见的疾病，而是一个被严重低估和漏诊的疾病。大量的患者可能因为其症状不典型，或者因为他们的基因变异被错误地归为 未知意义 ，而错过了诊断和精准治疗的机会。

从一个基因到整片星空：精准医学的未来已来

回顾这项研究，我们仿佛跟随研究人员完成了一场精彩的破案之旅。他们从基因测序带来的 VUS困境 出发，利用碱基编辑和高通量筛选技术，铸造了一把强大的 变异分类器 。他们用这把钥匙，系统性地破译了PIK3CD和PIK3R1两个基因上百余个 神秘字符 的含义，绘制出了一幅前所未有的高分辨率功能地图。这张地图不仅帮助我们理解了疾病的分子机制，还意外地揭示了不同基因型对靶向药物敏感性的差异，并指导了克服耐药性的联合治疗策略。最终，通过将实验室的发现与大规模人群数据相结合，他们颠覆了我们对一种 罕见病 流行率的传统认知。

这项工作的意义远远超出了APDS本身。它建立了一个从 变异到功能，再到临床 的完整研究范式。这个范式可以被广泛应用于数百种其他的先天性免疫缺陷，乃至更多由单基因变异引起的遗传病。它为解决长期困扰基因诊断的VUS问题提供了一个可扩展的、强有力的解决方案。

未来，我们可以想象，当医生在患者报告上看到一个VUS时，他们不再需要束手无策地等待。他们可以查询一个动态更新的、由类似功能筛选实验构建的 变异功能数据库 。这个数据库会明确告知他们，这个变异是GOF、LOF还是中性，它对特定药物的敏感性如何，甚至推荐潜在的联合治疗方案。这不再是科幻小说中的场景。这项发表在《细胞》上的研究告诉我们，通过巧妙的实验设计和前沿技术的融合，我们正在一步步将这个愿景变为现实。精准医学的未来，一个真正为每个个体 量身定制 方案的时代，已经伴随着这些基因 破译者 的脚步，悄然到来。

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