Nature Methods:开辟胞嘧啶碱基编纂器中靶效应检测的新对象 |
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北年夜-清华性命迷信结合中间、北京年夜学性命迷信学院伊成器传授课题组在Nature Methods杂志颁发了题为“Detect-seq reveals out-of-protospacer editing and target-strand editing by cytosine base editors”的封面文章。研讨职员在本研讨任务的次要奉献如下:
树立了一种无方向性的中靶检测技术
作者通过捕捉胞嘧啶碱基编纂器CBE[1]发生的(dU),并进行一系列标志和富集[2, 3],得到具备间断C-to-T渐变的中靶旌旗灯号,并将其定名为Detect-seq(dU-detection enabled by C to T transition during sequencing)技术,该技术的次要技术路线如图1所示。
研讨职员在人胚肾细胞HEK293T和人细胞MCF-7转染BE4max[4],使用多种分歧的sgRNA对基因组靶向位点进行C-to-T的编纂;同时对这些样本中进行了Detect-seq检测。通过Detect-seq检测发现,除RNF2位点外,其它靶向位点均可以发生几十至数百个Cas9依赖型的中靶位点(图2)。
发现了两种新型中靶位点(out-of-protospacer edit和target-strand edit)
乏味的是,研讨职员基于Detect-seq技术还发现了两种新型的Cas依赖型的中靶编纂:sgRNA联合区域外编纂(out-of-protospacer edit)及靶向链编纂(target-strand edit)(图3)。sgRNA联合区域外编纂即C-to-T的编纂产生在sgRNA联合区域外;而靶向链编纂则是C-to-T编纂产生在sgRNA与DNA联合链。依据Detect-seq的成果,上述两种编纂广泛存在于Cas9依赖型的中靶位点邻近。
综上所述,Detect-seq技术为碱基编纂畛域内提供了一种可能高敏锐、高特异、无偏好性地检测细胞内的CBE中靶位点的办法。中靶效应懂得的加深,也将为说明CBE的催化机制、优化改革更平安的CBE对象带来新的视角与能够。(100yiyao.com)
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