Nat Chem Biol：使用两种CRISPR酶，无需扩增，就可在20分钟内高敏锐地检测SARS

2021年8月11日讯/BIOON/---频仍、疾速地检测COVID-19关于节制疫情的舒展至关紧张，尤其是在呈现新的、更具传达性的SARS-CoV-2病毒变体时。

尽管如今金尺度的COVID-19测试使用qRT-PCR---定量逆转录聚合酶链式反馈---十分敏感，可以检测到每微升一个RNA拷贝，但它必要专门的设备、几个小时的运转光阴和一个集中的试验室举措措施。是以，测试通常必要至多一到两天的光阴。

在一项新的研讨中，由美国加州年夜学伯克利分校的Jennifer Doudna、David Savage和Patrick Hsu引导的一个研讨团队开辟出一种比qRT-PCR更疾速、更容易部署的测试办法。它如今联合了两种分歧类型的CRISPR酶，以构建一种可以在不到一小时内检测出少量病毒RNA的测试办法。相关研讨成果于2021年8月5日在线颁发在Nature Chemical Biology期刊上，论文题目为“Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases”。

尽管这种新技术还没有到达与qRT-PCR的敏锐度---可以检测到每微升液体中仅有的几个病毒拷贝---相媲美的阶段，但它可能检测到的病毒RNA程度---年夜约每微升液体30个病毒拷贝---足以用于监测人群和限定感化的传达。

Savage说，“鉴于这种测试办法足够不便和疾速，你不必要PCR的敏锐度，就能在社区中根本捕获和COVID-19。咱们愿望将生归天学尽能够地推动到你可以想象一种十分不便的模式，在一个情况中，你可以天天承受测试，比方说，在上班的入口处。”

几种基于CRISPR的测试办法曾经被美国食物药品治理局（）受权紧迫使用，但一切这些测试办法都必要一个初始步调，在这个步调中，对病毒RNA进行扩增，以便检测到旌旗灯号，这波及一种荧光分子在蓝光下收回的光线足够豁亮，以便可以察看到。尽管这种初始的扩增步调将测试的敏锐度进步到与qRT-PCR相似的程度，但它也引入了一些步调，使测试在试验室外更难进行。

这些作者试图在不牺牲检测的复杂性的环境下到达有用的敏锐度和速率。论文第一作者、Doudna试验室研讨迷信家Tina Liu说，“关于即时测试利用，你愿望有一个疾速的反馈，以便人们可能迅速晓得他们是否被感化，例如在你坐飞机或去访问亲戚之前。”

除了添加了一个步调之外，初始扩增的另一个缺陷是，因为它制作了数十亿份病毒RNA，是以在患者样本中呈现穿插净化的机遇更年夜。这些作者开辟的这种新技术将这一点旋转过去，转而加强了荧光旌旗灯号，打消了穿插净化的一个次要起源。这种无扩增的技术，他们称之为疾速综合核酸酶串联检测（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem, FIND-IT），可以对许多其他沾染病进行疾速和便宜的测试。

Liu说，“尽管咱们启动这个名目的明白目标是影响COVID-19，但我以为这种特别的技术可以实用于不仅仅是这种年夜风行病，由于究竟CRISPR是可以编程的。是以，你可以给CRISPR酶加载一个靶向流感病毒或HIV病毒或任何类型的RNA病毒的序列，而且该体系有后劲以异样的方式起作用。这篇论文真正确立了这种生归天学是一种更复杂的检测RNA的办法，而且有才能在敏感和疾速的光阴范畴内检测该RNA，这能够得当于将来期近时中的利用。”

这些作者今朝正在使用FIND-IT构建如许的一种办法，这将包含搜集和处置样本的步调，以及在一个紧凑的微流控设备上运转这种测试办法。

应用串联的Cas卵白

为了从这种测试办法中移除靶标扩增步调，这些作者采取了一种称为Cas13的CRISPR酶，起首检测病毒RNA，并使用另一种称为Csm6的Cas卵白缩小荧光旌旗灯号。

Cas13是一把用于切割RNA的通用铰剪；一旦它联合由导游RNA（gRNA）指定的目的序列，它就会被激活和切割一系列其他的RNA分子。这种靶标触发的切割活性可以被用来将特定RNA序列的检测与荧光申报分子的开释分割起来。然而，就其自身而言，当靶RNA的数目十分少时，Cas13能够必要几个小时能力发生可检测的旌旗灯号。Liu的新见解是使用Csm6来缩小Cas13的后果。Csm6是一种CRISPR酶，能感知小环状RNA的存在，并被激活以切割细胞中一系列RNA分子。

FIND-IT示用意，图片来自Nature Chemical Biology, 2021, doi:10.1038/s41589-021-00842-2。

为了进步Cas13的检测才能，Liu和她的共事们设计了一种颠末特别改革的激活剂分子，当Cas13检测到病毒RNA时，该激活剂分子就会被切割。这种激活剂分子的一个片断可以与Csm6联合并触发Csm6从RNA片断中切割并开释出一种豁亮的荧光分子。在正常环境下，这种激活剂分子会迅速被Csm6分化，从而限定了它能发生的荧光旌旗灯号的数目。Liu和她的共事们设计了一种办法，对这种激活剂进行化学修饰，使其免受降解，并可以对Csm6进行超强激活，以便重复切割和开释与RNA相连贯在一路的荧光分子。这招致了比原始激活剂好100倍的敏锐度。