国度药监局宣布4个中成药弥补测验布告

　　医药网8月24日讯　8月23日，国度药监局宣布了对于黄连上清丸等水丸中水稻源性身分查看项弥补测验办法等2项弥补测验办法的布告（2021年第101号）。

　　布告内容显示：依据《中华人平易近共和国药品治理法》及其施行条例的无关规则，《黄连上清丸（水丸）、龙胆泻肝丸（水丸）、防风通圣丸（水丸）和风寒咳嗽丸（水丸）中水稻源性身分查看项弥补测验办法》《龙胆泻肝丸中马兜铃酸I身分查看项弥补测验办法》经国度药品监视治理局同意，现予宣布。

　　附：查看项弥补测验办法

　　【查看】水稻源性身分

　　样品制备供试样品制备 取供试品过量，破碎摧毁，称取10 g，退出65℃预热的TE缓冲溶液（pH 8.0）（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA）50ml，65℃水浴振摇至完整疏散，立刻汲取0.5ml混悬液至2ml离心管中，即得。

　　尺度物资样品制备打水稻源性DNA检测尺度物资1支，加无菌超纯水100μl消融，即得。

　　空缺对还是品制备取0.5ml的无菌TE缓冲溶液至2 ml离心管中，即得。

　　模板DNA提取取上述样品，别离选用动物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取，得模板DNA溶液，贮存于-20℃备用。

　　PCR反馈辨别引物：5' TTAGCCTCCCGCTGCAGA3'和5' AGAGTCCACAAGTGCTCCCG3'。PCR反馈系统：在200μl离心管中进行，反馈总体积为25μl，反馈系统包括2×PCR预混液（包括DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反馈缓冲液等）12.5μl，辨别引物（50μmol/L）各0.2μl，模板DNA（或水稻源性DNA检测尺度物资）溶液2μl，无菌超纯水10.1μl。每个样品设置2个平行。PCR反馈参数：95℃预变性3分钟，轮回反馈40次（95℃30秒，62℃30秒，72℃30秒），72℃延伸10分钟，4℃保管反馈产品。

　　电泳检测照琼脂糖凝胶电泳法（《中国药典》2020年版公则0541），胶浓度为2.0%，胶中退出核酸凝胶染色剂GelRed；供试品、水稻源性DNA检测尺度物资和空缺对照溶液的上样量别离为10-20μl，DNA分子量标志物（建议使用DL500）上样量为5μl。电泳停止后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。

　　体系实用性（1）空缺对照在凝胶电泳图谱中应无条带检出；（2）水稻源性DNA检测尺度物资在凝胶电泳图谱50～100bp中应有条带检出。应同时知足以上2个前提，不然试验有效。

　　克隆测序使用贸易化PCR产品克隆试剂盒，将PCR特征条带克隆到T载体上，用Sanger法进行序列测定，与水稻参考序列进行比对阐发。

　　成果断定凝胶电泳图谱中，供试品在50～100bp间不得呈现与水稻源性DNA检测尺度物资年夜小一致的条带。若呈现响应的条带，其克隆测序成果与给定水稻参考序列应纷歧致。若呈现个体碱基差别，将克隆测序成果与NCBI数据库中其他水稻序列进行比对，不该100%婚配。

　　水稻参考序列

　　AGAGTCCACAAGTGCTCCCGCGCGTCC GAAGAAACCAACCACACTGCCGCTCTGCAGCGGGAGGCTAA。

　　备注本办法所用容器应为一次性耗材或颠末彻底荡涤和低压消毒并打消核酸净化的耗材，不然不行反复使用。试剂均为阐发纯或生化试剂，试验用水应契合GB/T6682的要求。一切试剂均用无DNA酶净化的容器艳服。

　　草拟单元：中国食物药品检定研讨院

　　复核单元：四川省食物药品测验研讨院