Nucleic Acids Research：开辟全面评价基因编纂产品新办法

起源：北京年夜学 2021-08-27 08:38

北京年夜学性命迷信学院和北年夜-清华性命迷信结合中间胡家志课题组在Nucleic Acids Research杂志在线颁发题为“Global detection of DNA repair outcomes induced by CRISPR-Cas9”和“In-depth assessment of the PAM compatibil

北京年夜学性命迷信学院和北年夜-清华性命迷信结合中间胡家志课题组在Nucleic Acids Research杂志在线颁发题为“Global detection of DNA repair outcomes induced by CRISPR-Cas9”和“In-depth assessment of the PAM compatibility and editing activities of Cas9 variants”的两篇研讨论文。在这两项研讨中，研讨职员先是“利其器”—开辟了可以同时评价Cas9靶向点编纂产品及中靶活性的新型生物信息对象PEM-Q。应用PEM-Q，研讨职员在人和小鼠细胞中对Cas9编纂后的产品进行了体系且定量的评价，为基因编纂的特同性和平安性提供了紧张启示。之后研讨职员应用PEM-seq/PEM-Q来“善其事”—对该畛域内今朝罕见的SpCas9变体的编纂活性，中靶活性及对基因组不稳定影响性进行了全面的评价和中靶预测，总结了这些变体在人类细胞中的编纂活性和中靶活性，为在这些变体之间进行选择提供指导。

用于基因组编纂的CRISPR-Cas9体系的倒退改动了性命迷信研讨的方式，同时也为疾病的医治以及生物技术的倒退带来了微小后劲。然而其中靶活性始终制约着其在临床医治上的进一步利用，同时在基因组编纂进程中发生的染色体异常构造，包含染色体年夜片断缺失和易位也是今朝临床利用的一年夜阻碍，近期也惹起了许多试验室的存眷。作者起首在2019年颁发的PEM-seq的根底上，应用其新开辟的生物信息阐发对象PEM-Q对Cas9编纂后的产品，副产品进行了全面且定量的评价。PEM-Q检测到年夜量无害的DNA修复产品，以小鼠CH12F3细胞中c-Myc位点为例，有近3%的年夜片断缺失（ 100bp）、近1%的整合和近3%的染色体易位。同时作者进一步探求了这些产品发生的机制，发现年夜片断缺失次要依赖于切割位点邻近的微同源序列，整合则与的软弱性相关，而中靶或其他重复呈现的DNA断裂则主导了染色体易位。以上发现为基因组编纂的平安性提供了除中靶效应之外的另一个维度，为基因编纂对象的递送方式提供指导。

为了削减SpCas9的中靶活性及拓宽其靶向范畴，该畛域任务者开辟出了多种SpCas9变体。作者进一步应用PEM-seq/PEM-Q办法，对现今罕用的8种SpCas9高保真变体（eSpCas9， FeCas9， HF1， Hypa， evo， HiFi， LZ3， Sniper ) 以及4种靶向范畴更普遍的广域编纂变体（xCas9， Cas9-NG， SpG， SpRY）的切割活性，中靶环境和基因组不稳定性进行了体系且定量的评价。作者发现广域编纂变体具备加倍重大中靶活性和切割本身表白载体的征象（图2A，2C）。近乎无PAM序列限定的SpRY在靶向RAG1位点时，检测到了188个中靶位点，其中靶活性让人赞叹。此外，作者使用了一套深度培训的模子来预测SpRY中靶环境，发当初一切中靶位点中前15个和67/80个预测的位点都是真正的中靶位点（图2B）。末了作者将SpRY与三个高保真SpCas9变体联合起来，发生了三个同时具备高保真和普遍编纂范畴的新型变体（图2D）。

总的来说，这两篇文章的任务体系地评价了CRISPR-Cas9编纂进程中的DNA修复产品并论述其影响机制，提示咱们基因编纂时克制非同源末尾连贯（NHEJ）的潜在诱变风险。全面评价多种SpCas9变体的切割活性和特同性，匆匆进这些变体在适宜的基因编纂配景下的利用。同时，这两项任务的研讨成果提示Cas9的平安性评价不该仅局限于中靶效应，靶位点年夜片断的删除和染色体构造变异也应该获得看重。末了，研讨成果提示染色体异常构造不克不及通过使用SpCas9高保真变体来削弱，而以往通过克制DNA毁伤修复通路来加强同源重组效率的方式也并不行取。以是今朝亟需寻觅一种既可以坚持基因编纂对象编纂活性又能无效下降中靶活性和染色质构造变异的基因编纂对象。如许，能力使基因编纂对象更普遍、更平安地利用于临床。(100yiyao.com）

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