RNA修饰办法学取得紧张停顿

起源：中山年夜学性命迷信学院 2021-10-21 22:27

RNA被以为是性命呈现伊始就存在的生物年夜分子。漫长的演变历程中，RNA逐步从性命信息存储和表白的双重身份中特化进去，成为通报信息的序言。处在中间法令中心的RNA，即不像DNA存储遗传信息，也不像卵白质间接体现性命运动，只有以少数特例存在的模式下，如病毒、核酶，还揭示人们它仍旧保留来自远古的使命。近年来，表观转录组学（epitranscriptomics）学说

RNA被以为是性命呈现伊始就存在的生物年夜分子。漫长的演变历程中，RNA逐步从性命信息存储和表白的双重身份中特化进去，成为通报信息的序言。处在中间法令中心的RNA，即不像DNA存储信息，也不像卵白质间接体现性命运动，只有以少数特例存在的模式下，如病毒、核酶，还揭示人们它仍旧保留来自远古的使命。近年来，表观转录组学（epitranscriptomics）学说的提出为该畛域注入了新的思维。人们发现，真核生物分歧品种RNA上存在超过150种分歧的化学修饰，此中很年夜部门继承于陈旧的独特祖先。这些修饰或参加了RNA与其它年夜分子的互作，或影响了RNA自身的代谢，在性命进程中起着至关紧张的作用。 精确且定量地鉴定RNA修饰位点及其修饰比例，是深化相识RNA修饰的散布、功效及其背地的机理机制的条件。然而若何获得高置信度、单碱基精度RNA修饰位点，以及对修饰位点的精准定量是今朝畛域内的研讨难点。近年来，多种新技术的呈现使得检测全转录组中的各类RNA修饰位点成为能够。虽然畛域内已有多种RNA修饰检测办法可供选择，然则在理论利用中后果往往差能人意。高假阳性率、低分辩率的成绩时常困扰研讨者。某些环境下，分歧研讨报道的统一种修饰的位点数乃至能相差2-3个数目级。即便是今朝绝对成熟、利用最广的MeRIP-seq技术，也存在年夜量非特同性抗体富集和低反复性成绩。 为相识决RNA修饰检测中所面对的办法学难题，中山年夜学性命迷信学院骆观正传授团队提出了一种新的办法。通过构建全转录组无修饰RNA文库作为负对照，全面评价了现有基于二代测序的RNA修饰检测技术，并为修饰位点的准确鉴定提供体系的解决方案。该研讨结果颁发在Nature Methods杂志上，题为公众Systematic calibration of the epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library "大众。中山年夜学性命迷信学院为第一签名单元，副研讨员张璋和博士后陈涛为独特第一作者，骆观正传授为通信作者。文中所波及到的办法已申请创造专利。 面临乐音较年夜的生物数据，引入对照来辨别假阳性是经典的思绪。在古人的研讨中，为了进步现有修饰检测办法的可托度，有时会应用负对还是本对成果进行校订。比方有研讨使用敲除甲基转移酶(“writer”)的样品作为对照。或许应用去甲基红酶（eraser）在体外反馈得到去除修饰的样本，亦或是使用合成的无修饰的RNA oligo。然而这些负对还是自身存在较年夜的不敷，比方体外反馈很难完整去失落修饰位点，合成的RNA oligo只能代表部门序列等。是以，最好的负对还是本应该具备与内源转录组异样的序列和基因表白程度，然则并不含有修饰碱基的一套完全的人工转录组。本研讨采取体外合玉成转录组RNA (IVT RNA) 文库的办法构建了无修饰的RNA文库（图1），随后将其作为负对照用来校订现有的修饰检测办法。文中以两种最受存眷的RNA修饰m6A和m5C作为代表，别离验证了该办法在三种典型研讨场景中的无效性（图2）。 MeRIP-seq（或m6A-seq）是今朝最罕用的RNA修饰检测办法，被年夜范畴的用在m6A相关研讨中。该办法原理是用m6A特同性的抗体对片断化的RNA进行免疫积淀反馈，将含有m6A的片断富集进去进行测序。在研讨同时对体外转录IVT RNA文库也进行MeRIP-seq，成果标明即便是对不含m6A修饰的IVT RNA文库，抗体照旧可能富集到年夜量RNA片断，而且这些富集的“peak”在已颁发成果数据中反复呈现，标明MeRIP-seq其实遭到假阳性旌旗灯号的重大烦扰。阐发IVT RNA中被富集上去的区域，发现这些区域地点的基因表白量较高且富含腺嘌呤。去除假阳性旌旗灯号后，鉴定进去的修饰区域更精确（图3）。 m6A-REF-seq是一种借助m6A敏感内切核酸酶MazF来完成的m6A单碱基检测办法。该办法由骆观正课题组和以色列魏茨曼迷信研讨学院Schraga Schwartz组在2019年别离自力颁发（详见Cell+Sci Adv独特存眷丨抗体非依赖m6A精准鉴定办法，助力解决畛域内严重争议https：//mp.weixin.qq.com/s/nokmeX7gt5VoiuKK4iepKw）。在本研讨中，作者将IVT RNA样本作为负对照进行m6A-REF-seq校订，发现确切存在年夜量假阳性位点。高精准度的m6A单碱基图谱也为畛域提供了新的常识，如扩大motif序列，定量散布纪律等，为进一步深化阐发m6A的机制和功效发明了条件。通过对假阳性位点的深化阐发，发现某些特定序列和RNA二级构造会烦扰MazF酶切反馈，是发生假阳性的次要起因（图4）。 末了该研讨把IVT RNA利用到另一种罕见RNA修饰m5C的检测中。BS-seq使用重亚硫酸盐对不含修饰的C进行处置，使其在PCR之后转换为T，而m5C修饰并不克不及进行该转换。在研讨中要是处置不完整，会引入年夜量的假阳性位点。该研讨在BS-seq中退出IVT RNA作为负对照，获得高置信度的m5C位点，同时发现即便重亚硫酸盐处置得不长短常严厉，引入IVT RNA依然可能起到显明的校订后果，下降了检测成果中的假阳性率。(100yiyao.com）

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