一种新的GRAB荧光探针用于检测细胞外ATP的时空动态变化

来源：北京大学2021-12-30 08:35

三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷(Ado)等嘌呤分子广泛存在于细胞内外。细胞内嘌呤分子主要负责调节细胞能量代谢过程。细胞外嘌呤分子作为信号分子(称为“嘌呤递质”)，通过作用于相应的受体，调节呼吸调节、味觉和睡眠等生理活动。目的递质及其受体也参与调节病理状态，如癫痫、疼痛、炎症反应、脑外伤和缺血。

三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷(Ado)等嘌呤分子广泛存在于细胞内外。细胞内嘌呤分子主要负责调节细胞能量代谢过程。细胞外嘌呤分子作为信号分子(称为“嘌呤递质”)，通过作用于相应的受体，调节呼吸调节、味觉和睡眠等生理活动。目的递质及其受体也参与调节病理状态，如癫痫、疼痛、炎症反应、脑外伤和缺血。此外，嘌呤能信号障碍与抑郁症、精神分裂症等精神疾病密切相关。到目前为止，破译嘌呤能信号功能的一个主要技术瓶颈是缺乏灵敏、特异、无创的工具，无法以高时空分辨率报道嘌呤递质的动态变化。

北京大学李玉龙实验室在Neuron杂志上在线发表了一篇题为“一种用于检测体内细胞外ATP的灵敏抓取传感器”的研究论文，报告了一种新的基因编码ATP探针GRABATP1.0的开发及其在体外和体内动物中的应用。自2018年以来，李玉龙实验室开发了针对乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、腺苷、血清素、内源性大麻素等神经递质或调节剂的荧光探针。这次发布的GRABATP1.0是它的又一力作，进一步扩展了GRABATP1系列荧光探针家族。

在这项工作中，李玉龙的实验室开发了基于人类三磷酸腺苷受体P2Y1的三磷酸腺苷探针GRABatp1.0(简称atp1.0)，并通过使用其先前设计的Grab探针策略(基于GPCR激活的传感器)循环重排绿色荧光蛋白cpEGFP。ATP1.0探针在体外培养的HEK293T细胞、原代神经元和星形胶质细胞中显示出优异的细胞膜定位。神经元表达的ATP1.0信号反应约为780%，亲和力约为80 nM (EC50)，对外源ATP和ADP具有高度的分子特异性(图1)。此外，ATP1.0可以在亚秒级上响应细胞外ATP浓度的变化。

ATP1.0探针能否用于检测内源性ATP释放？作者从原代培养的海马细胞入手，发现ATP1.0可以检测机械刺激和低渗透压刺激诱导的ATP释放。药理实验和突变探针实验进一步验证了ATP1.0检测信号的特异性(图2)。有趣的是，ATP1.0无需额外刺激即可灵敏记录直径约30微米的自发ATP释放事件，表明ATP释放具有化学分子特异性和空间特异性。

ATP1.0探针能否用于活体动物？之前的研究发现，当细胞受损时，细胞内毫摩尔的ATP会被释放出细胞，被周围的胶质细胞感受为“危险信号”，从而激活小胶质细胞释放趋化因子等，产生免疫反应。胶质细胞上表达的嘌呤受体在小胶质细胞信号因子的激活、迁移和分泌中起重要作用。那么，在这个过程中，ATP的传递和小胶质细胞的迁移是如何动态变化的呢？作者在斑马鱼体内表达了ATP1.0探针，发现激光照射造成局部损伤时，ATP释放呈现“波浪形”传播。通过在标记有红色荧光蛋白小胶质细胞的转基因斑马鱼中表达绿色ATP1.0探针，可以直观地检测到带有ATP信号传递的小胶质细胞的迁移过程。

大脑处于疾病状态时，ATP释放会表现出哪些变化？如上所述，嘌呤能信号在免疫中起着重要作用。为了检测免疫应答过程中脑内ATP信号的变化，作者通过腹腔注射脂多糖(LPS)引发小鼠全身免疫应答，采用AAV病毒介导法在小鼠大脑皮层表达ATP1.0，并通过双光子成像记录ATP信号。有趣的是，注射LPS后，小鼠大脑皮层呈现出强烈但空间特异性的ATP信号上升现象。(100yiyao.com)

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