PNAS:揭示中间丝在寨卡病毒感染宿主细胞中的双重作用

来源：上海巴斯德研究所2022-02-28 08:15

中国科学院上海巴斯德研究所葡萄酒亚明研究组发表了一篇关于PNAS的论文，题为《宿主细胞骨架波形蛋白作为结构组织者和RNA结合蛋白调节剂促进寨卡病毒复制》。

中国科学院上海巴斯德研究所葡萄酒亚明研究组发表了一篇关于PNAS的论文，题为《宿主细胞骨架波形蛋白作为结构组织者和RNA结合蛋白调节剂促进寨卡病毒复制》。本研究利用多种显微成像技术和组学分析，首次阐述了波形蛋白在寨卡病毒感染中的物理空间支持和生物学功能调节双重作用。

寨卡病毒(Zika virus，寨卡病毒)是一种黄病毒，具有包被的单链正义RNA，可引起小头畸形和格林-巴利综合征等神经系统疾病。ZIKV进入细胞后，会在内质网膜上复制，产生大量双链RNA、病毒基因组RNA和病毒蛋白质。这些病毒成分聚集在细胞核周围，与劫持的宿主因子一起形成病毒复制工厂，提供高效的病毒复制。然而，尚不清楚在此过程中严重重建的宿主细胞骨架发挥什么生物学功能。

细胞骨架包括微丝、微管和中间丝，它们相互交织形成网络，为细胞提供机械支持，参与细胞器定位、物质运输和信号传递等重要的生物学过程。波形蛋白丝属于细胞骨架的中间丝，主要呈放射状分布于细胞核周围至细胞边缘。近年来有研究发现，在病毒感染过程中，波形蛋白丝会发生重构并聚集在细胞核周围，但其在ZIKV感染过程中的动态变化和生物学功能尚不清楚。此外，细胞骨架蛋白还可以参与细胞内转录和翻译机制的调节。然而，波形蛋白与细胞内转录翻译机器之间的物理空间和生物学功能关系尚不清楚，尤其是在病毒感染的情况下，波形蛋白细丝与病毒复制工厂之间的联系完全未知。

利用共聚焦显微镜、实时观察活细胞、超高分辨率显微镜和电子显微镜，观察到随着ZIKV感染时间的延长，细胞内的波形蛋白丝逐渐聚集在细胞核周围，形成笼状结构包裹病毒复制工厂成分如dsRNA、NS4B和Env(图1)。病毒蛋白Env的内源性表达也可以诱导波形蛋白丝的类似现象。

过去有报道称，在各种病毒感染中，波形蛋白丝会出现类似的重塑现象。为了进一步探索这种变化的具体意义和机制，研究人员利用CRISPR/Cas9技术敲除人骨肉瘤细胞系U2OS和人细胞系Huh7中的波形蛋白，发现病毒复制工厂中NS4B、Env或dsRNA成分的细胞内定位从核周聚集变为多块分散，使得病毒RNA复制、蛋白质合成、子代病毒产生和整体感染率显著。只有在敲除细胞中补充全长波形蛋白，病毒复制工厂才能在波形蛋白丝的包裹下重新聚集在细胞核周围，而补充只能形成单位长度丝(ULF)的波形蛋白并不能挽救其分散的表型。发现ZIKV感染后，细胞中的另一种中间丝和波形蛋白聚集到病毒复制工厂，但巢蛋白基因的单个敲除不影响ZIKV复制，而波形蛋白的单个敲除影响巢蛋白的表达和病毒复制工厂的位置。结果表明，波形蛋白保证了ZIKV复制工厂中高密度的核周细胞聚集，这是病毒高效感染的必要条件，其功能在细胞的各种中间丝中是独特而重要的。

为了找出波形蛋白具体影响寨卡病毒感染的哪些步骤，研究人员在野生型和波形蛋白敲除细胞系中进行了不同感染时间点的实验，以及病毒结合/进入细胞的实验。结果表明，敲除波形蛋白不影响寨卡病毒结合或进入细胞，但病毒蛋白的积累持续低于野生型细胞。为了区分这种病毒蛋白的减少是合成的减少还是降解的增加，我们研究了病毒Env-EGFP和NS4B-EGFP蛋白在两种细胞中的过量表达，并分别用蛋白合成抑制剂cyclohemide)、蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂NH4Cl处理，发现波形蛋白影响的是病毒蛋白的合成而不是降解。

波形蛋白丝的细胞内定位在正常条件下和ZIKV感染下与内质网高度一致，敲除波形蛋白使内质网更加弥散，表明波形蛋白与内质网之间存在重要的联系。利用质谱结果，我们发现细胞内波形蛋白和位于内质网的RNA结合蛋白(RBPs)之间存在相互作用。进一步的RNA测序分析表明，与野生型细胞相比，波形蛋白基因敲除细胞感染病毒后，具有双链RNA结合功能和转录调控功能的内质网相关基因表达显著下调，进一步证实了波形蛋白参与了寨卡病毒RNA复制的过程。基于两种组学分析的结果，本研究重点研究了内质网上的跨膜蛋白1(核糖体结合蛋白1，RRBP1)，并通过体外蛋白质下拉试验验证了波形蛋白与RRBP1之间的相互作用。2019年有报道称RRBP1可以直接结合病毒RNA，帮助黄病毒复制。RRBP1基因的缺失使细胞内寨卡病毒RNA水平降低了约40%。为了分析波形蛋白和RRBP1分子在ZIKV感染中的关系，在野生型细胞和波形蛋白敲除细胞中敲除RRBP1基因的表达，观察两种细胞的细胞内表达和定位，并比较两者感染ZIKV的情况。结果显示，波形蛋白的缺失使RRBP1的mRNA和蛋白水平降低了50%左右，RRBP1和内质网信号在细胞内的定位更加分散，类似于病毒复制工厂分散的现象。RRBP1与内质网的共定位关系保持不变，但RRBP1与ZIKV dsRNA的共定位水平显著下降。这表明，波形蛋白在ZIKV感染后内质网的精细变态中起着重要作用，使病毒复制工厂保持紧凑的结构，并聚集其他宿主分子如参与病毒转录和翻译的er相关蛋白，使其保持高效复制。相反，RRBP1敲除不影响波形蛋白的转录和翻译水平以及细胞内定位。单独敲除波形蛋白比单独敲除RRBP1更能降低病毒复制，抑制效率与双敲除相似，这表明波形蛋白作为RRBP1的上游分子，调控其参与病毒RNA复制的过程。