细胞研究:为了治疗隐性遗传性耳聋 舒以来/李花伟/左开发了HMEJ基因修复系统

来源：生物世界2022-03-01 08:22

根据世界卫生组织(WHO)的统计，全球人口的5%以上，即4.66亿人患有致残性听力障碍，其中3400万为儿童。虽然目前已发现120多个基因与非综合征型或综合征型耳聋相关(http://loss.org/)，但除了佩戴助听器和植入人工耳蜗外，遗传性感音神经性耳聋尚无有效的药物治疗。

根据世界卫生组织(WHO)的统计，全球人口的5%以上，即4.66亿人患有致残性听力障碍，其中3400万为儿童。虽然已发现120多个基因与非综合征型或综合征型耳聋相关(http://loss.org/)，但除了佩戴助听器和植入人工耳蜗外，感音神经性耳聋尚无有效的药物治疗。

在非综合征型遗传性耳聋中，常染色体隐性遗传性耳聋占80% (Korver等，2017)。对于隐性耳聋，最好的治疗方法是准确修复基因突变位点，从而长期恢复听力。CRISPR/Cas9基因编辑系统是一种新型的基因编辑工具，在疾病治疗中显示出巨大的应用潜力。该系统主要由两部分组成，sgRNA和Cas9，它们形成一个复合体。sgRNA与靶位点反向互补实现定位后，同时识别PAM序列，Cas9核酸酶切割DNA，导致DNA断裂。

细胞中DNA损伤修复主要有两种机制，非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)。当外源DNA模板存在时，可以利用HR实现序列的任意精确转化或定点插入，但其效率不高，尤其是在非分裂细胞中，这大大限制了HR在该领域的应用。

在前期研究中，研究组通过在同源模板两侧引入sgRNA的靶位点，开发了基于同源介导末端连接(HMEJ)的基因敲入策略(姚等，2017)，实现了体内外的高效、准确整合(图1)。HMEJ介导的基因敲入方法为基因编辑动物模型的建立和性疾病的精确靶向基因治疗提供了广阔的前景。目前，还没有基于CRISPR/Cas9介导的HR策略的耳聋体内研究。

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒以来研究员和教授与中国农业科学院农业基因组研究所左研究员合作。他在《细胞研究》杂志上发表了一篇题为“通过体内crispr/CAS9介导的优化人类学定向修复治疗小鼠的自动接收损失”的研究论文。

本研究以AAV为递送系统，采用HMEJ基因敲入方法，准确纠正Klhl18lowf隐性耳聋小鼠听毛细胞中的点突变，恢复内毛细胞的静纤毛形态，治疗后最长6个月显著改善小鼠的听觉功能。

这是首个基于CRISPR/Cas9-HMEJ技术治疗隐性遗传性感音神经性耳聋的成功研究，为精准治疗性耳聋和潜在的临床转化提供了有力的科学依据。

Klhl18lowf小鼠模型是指KL18P中的错义突变(CHR 9: 110455454CA)。V55F。纯合子小鼠在第4周表现出逐渐的低频听力损失。随着年龄的增长，听力损失逐渐累及其他频率，最终发展为全频率重度耳聋，而杂合子小鼠听力正常，呈隐性遗传。Klhl18lowf隐性耳聋小鼠模型的特征是耳蜗毛细胞纤毛形态异常(英厄姆等，2021)。

本研究首先根据Klhl18lowf基因的突变位点设计、筛选并构建了HMEJ处理系统。新生小鼠皮肤成纤维细胞sgRNA的体外筛选表明，sgRNA2具有较高的效率。将表达Cas9的质粒、携带HMEJ同源模板的质粒和表达sgRNA2的质粒共转染到具有Klhl18lowf突变的成纤维细胞中。发现突变位点被明显纠正，sgRNA2没有产生明显的脱靶编辑。

体外实验证实了所设计的HMEJ系统能够准确纠正Klhl18lowf点突变，本研究进一步探讨了该系统在体内的功效。CRISPR/Cas9-HMEJ基因修复系统，即AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP . e b-SG RNA-供体，用双AAV包装，出生后一天显微注射入Klhl18lowf新生小鼠(P1)内耳。在小鼠P14和10周龄时，体内编辑效率测试的结果表明，双AAV处理系统成功地在体内纠正了Klhl18基因C A点的突变，并且随着编辑时间的延长，10周龄时的修复效率提高了约3倍，而在未注射的耳朵中没有观察到明显的碱基插入、缺失或突变的纠正。

通过扫描电镜观察，与野生型小鼠相比，发现8周龄未处理的纯合突变小鼠的内毛细胞中最高一排静纤毛较长，较细，顶端呈锥形，而处理小鼠的内毛细胞中部分静纤毛恢复正常形状，显示最高一排静纤毛多为圆柱形，较短。经处理后，小鼠耳蜗顶圈和中圈约16%的内毛细胞具有正常或接近正常的纤毛束形态。听觉脑干反应(ABR)测试结果显示，在注射AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治疗系统8周后，注射耳的ABR阈值在8、16、24和32 kHz显著低于未注射耳，且治疗效果持续至小鼠24周龄(实验观察期)。电生理测试结果显示，在长时间去极化脉冲刺激(200 ms)条件下，未注射耳内毛细胞的细胞膜电容明显低于野生型，而AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ处理系统可使注射耳内毛细胞的细胞膜电容恢复至野生型水平，即处理系统修复了内毛细胞的持续囊泡释放功能。