《自然》:重新设计Cas9蛋白解决脱靶问题 让基因编辑更安全

来源：生物世界2022-03-05 21:58

CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过引导RNA(gRNA)，将Cas9酶靶向到靶DNA序列，Cas9酶切割靶DNA双链，造成DNA双链断裂，在非同源末端连接(NHEJ)的修复中出错，从而实现基因敲除。然而，CRISPR-Cas9具有严重的脱靶效应，可能会在错位的基因位点切割双链DNA，从而导致潜在的风险，这也限制了CRISPR-Cas9基因的临床编辑。

CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过引导RNA(gRNA)，将Cas9酶靶向到靶DNA序列，Cas9酶切割靶DNA双链，造成DNA双链断裂，在非同源末端连接(NHEJ)的修复中出错，从而实现基因敲除。

然而，CRISPR-Cas9具有严重的脱靶效应，可能会在错位的基因位点切割双链DNA，从而导致潜在的风险，这也是限制CRISPR-Cas9基因编辑临床应用的一大因素。目前国内外已经开始了一批基于CRISPR-Cas9的基因编辑，减少脱靶效应是一个亟待解决的问题。

德克萨斯大学奥斯汀分校的研究团队在《自然》杂志上发表了题为“CRISPR-cas 9错配监控的结构基础”的研究论文。

研究团队首次在CRISPR-Cas9基因编辑系统中发现了缺失背后的结构机制，并在此基础上重新设计了Cas9蛋白——SuperFi-Cas9，将缺失概率降低了数千倍，编辑效率与原始版本的Cas9蛋白相同。

CRISPR-Cas9基因编辑，通过引导RNA(gRNA)将Cas9酶靶向靶DNA序列，Cas9酶切割靶DNA双链，引起DNA双链断裂，从而实现基因编辑，其中引导RNA(gRNA)长20bp，通过与靶DNA的碱基互补配对识别待编辑位点。但有时候，Cas9酶在第18-20个碱基不匹配的情况下，仍然可以编辑。

研究团队利用冷冻电镜观察Cas9与错配DNA序列相互作用时的结构变化，从而分析Cas9在错配过程中的激活机制。

研究小组惊讶地发现，当指导RNA(gRNA)在第18-20个碱基错配时，此时配对结构松散，但Cas9酶并没有放弃，而是通过一种指状结构紧紧抓住错配区域，从而稳定了RNA-DNA双链，使其表现得像正确的配对，为Cas9切割DNA铺平了道路。这篇论文的第一作者杰克布拉沃(Jack Bravo)说，这种情况就像一把椅子，其中一条腿断了，用胶带绑着。这时候还能当椅子用，只是有些摇摇晃晃。

俗话说，眼见为实。这篇论文的通讯作者大卫泰勒说：如果我们没有在冷冻电镜下引导RNA(gRNA)错配过程中看到Cas9的这种指状结构，我们永远不会想到Cas9通过这种机制增加了错配过程中的结构稳定性，从而导致脱靶效应。

基于这一突破性的发现和洞察，研究团队重新设计了Cas9酶，一种新版本的Cas9酶——SuperFi-Cas9，其指状结构被修改为远离DNA，从而不会在错配时用于稳定错配结构，因此Cas9酶不再切割和编辑错配位点的DNA序列。

更重要的是，重新设计的SuperFi-Cas9可以像天然Cas9酶一样高效地编辑DNA，但错过概率降低了约4000倍，因此安全性大大提高。

目前，其他实验室已经重新设计了Cas9，以减少其脱靶效应，但所有这些Cas9版本都以牺牲基因编辑效率为代价提高了准确性。

对于这种情况，这篇《自然》论文的第一作者杰克布拉沃(Jack Bravo)做了一个形象的比喻：不同实验室开发的不同版本的Cas9就像不同型号的自动驾驶汽车，其中大部分是安全的，但它们的最高时速只有10英里。虽然安全性提高了，但实用性也没了。SuperFi-Cas9是一辆自动驾驶汽车，可以全速行驶，非常安全。SuperFi-Cas9的漏检概率比原版Cas9低4000倍，编辑效率一样高。

目前，研究小组已经证明SuperFi-Cas9在试管中编辑DNA，在活细胞中进行测试的实验正在进行中。他们还在开发更安全、更高效的Cas9版本。(100yiyao.com)

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