《自然》子刊:北大胡佳芝团队开发出更安全的Cas9变种Cas9TX

来源：生物世界2022-03-10 08:02

CRISPR-Cas核酸酶是目前应用最广泛的基因编辑工具，在基础科学研究和临床应用中具有广阔的应用前景。然而，除了脱靶活性，CRISPR-Cas还产生染色体结构异常，如染色体易位和大片段染色体缺失。这些副产物严重威胁基因组的稳定性，并与癌症的发生有关，从而成为CRISPR-Cas应用的一大障碍。2021年10月，一名淋巴瘤患者接受了。

CRISPR-Cas核酸酶是目前应用最广泛的基因编辑工具，在基础科学研究和临床应用中具有广阔的应用前景。然而，除了脱靶活性，CRISPR-Cas还产生染色体结构异常，如染色体易位和大片段染色体缺失。这些副产物严重威胁基因组的稳定性，并与癌症的发生有关，从而成为CRISPR-Cas应用的一大障碍。

2021年10月，一位淋巴瘤患者接受了同种异体的下一代通用CAR-T候选药物ALLO-501A的治疗，他的所有血细胞系都减少了。活检分析显示，他体内出现了染色体畸变的CAR-T细胞。因为染色体异位可能导致癌症，考虑到这一严重的潜在风险，同种异体公司的所有CAR-T被暂停。

随着基因编辑临床应用的不断普及，编辑细胞染色体易位不可控的患者必然会逐渐增多。然而，由于对基因编辑过程中染色体结构异常的机制缺乏了解，没有有效的策略来抑制此类副产物的出现。

北京大学生命科学学院和北京大学-清华生命科学联合中心的胡佳芝研究组在《自然通讯杂志》发表了题为：CAS9EXO-endo核消除基因组编辑过程中的染色体易位的研究论文[1]。

本研究揭示了基因编辑过程中染色体易位的分子机制，设计开发了一种安全性大大提高的新型基因编辑酶——Cas9TX。Cas9TX可以抑制基因编辑过程中染色体易位、大片段缺失等染色体结构异常，大大提高CRISPR-Cas9基因编辑的安全性，将编辑过程中的DNA损伤降低到与目前最安全的碱基编辑器相当的水平。Cas9TX可能是目前最安全的CRISPR-Cas9编辑变种。

值得一提的是，研究团队将Cas9TX应用于下一代通用CAR-T细胞，发现Cas9TX在不影响CAR-T杀伤效率的情况下，将靶向位点间的染色体易位降低至背景水平。

基于2019年胡家志研究组开发的综合评价基因编辑安全性的方法PEM-SEQ [2]，研究组首次对新一代CAR-T技术的安全性进行了评价。PEM-seq方法的详细操作指南也发表在2022年的STAR protocols of Cell系列中[3]。

结合基因编辑技术构建下一代通用CAR-T细胞，可以在产生CAR-T细胞的同时敲除TRAC、B2M、PDCD1等基因，可以减少供受体之间的免疫排斥反应，实现同种异体移植的可能性，同时提高CAR-T细胞的杀伤能力。本研究中，作者首次使用PEM-seq检测新一代CAR-T细胞染色体结构异常的概率，分析表明染色体易位一般发生在Cas9的多个靶向位点之间，约占主编事件的1%。这意味着在CAR-T细胞治疗中，每10 8个CAR-T细胞输给患者，就有超过10 6个细胞携带染色体易位。

但值得注意的是，以往对淋巴瘤的研究表明，TRAC附近存在转录增强子，可以极大地促进基因表达，并且可以提高易位后附近原癌基因的表达水平。这项研究进一步指出，目前该领域常用于消除脱靶活性的Cas9的高保真变体不能有效抑制Cas9靶位点之间染色体易位的发生(图1)。

为了探索基因编辑过程中染色体易位的规律，本研究对PEM-seq数据进行了详细的分析，作者意外地发现Cas9的靶位点和非靶位点之间的易位连接存在明显的方向性偏好。理论上，DNA切割后，两端应该是无偏好随机组合的，但实际上，末端组合偏离了1: 1的理论值(图2)。通过这样一个“真的很奇怪”的发现(注：艾萨克阿西莫夫曾说过，在科学探索中能听到的，可能预示着新发现的最激动人心的词，不是“我发现的”，而是“真的很奇怪”。)，研究团队发现了基因编辑过程中染色体大量易位的主要原因之一，即Cas9在靶位点和非靶位点的重复切割(如下图2)。这一机制的发现也解决了困扰Fred Alt等实验室近十年的一个问题：为什么G1后期的细胞比生长中的细胞更容易形成染色体易位？

随后，作者尝试将核酸的核酸外切酶与Cas9偶联，在编辑过程中通过修饰DNA的断裂末端来降低完美修复产物的比例，从而抑制Cas9的重复切割(图2下)。通过对各种核酸外切酶的筛选，本研究最终将优化的人TREX2蛋白与Cas9偶联，生成核酸外切酶Cas9TX。PEM-seq分析表明，Cas9TX确实可以抑制Cas9的重复切割，几乎消除染色体易位的发生。然后通过全基因测序的手段，作者验证了Cas9TX不引起基因组的非特异性切割，能够稳定有效地抑制和消除染色体易位的发生，与引起DNA单链断裂的碱基编辑器达到了同一水平。此外，研究人员发现，Cas9TX还可以大大减少大染色体缺失的产生。