浙江大学和药科大学团队发现大肠癌细胞可以“丢弃”抑癌因子

来源：奇点蛋糕2022-04-03 18336017

浙江大学张洪河和中国药科大学赖茂德领导的研究团队阐明了circRHOBTB3在大肠癌(CRC)进展中的生物学作用、环化过程和分泌途径。

Circ RNA(circRNA)是一种新的内源性非编码RNA(ncRNA)，参与细胞增殖、黏附、凋亡和存活等多种生物学过程[1]。

近年来，circRNAs在癌症领域也获得了越来越多的关注。研究表明，许多circRNAs可以促进细胞周期的发展，抑制或诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤的形成等[2]。不同的环在肿瘤的发展中起着不同甚至相反的作用。

虽然越来越多的研究报告了异常circrna，和[3]，但circrna在肿瘤细胞中的生物学功能、分子机制和环状模式仍不清楚。此外，有研究提出，circRNAs可以通过病理功能未知的外泌体分泌到循环中[4]，比线性RNA更容易分选成外泌体。然而，circRNAs的外来体特异性分选机制仍然完全未知。

近日，浙江大学张洪河和中国药科大学赖茂德领导的研究团队，阐明了circRHOBTB3在大肠癌进展中的生物学功能、环化过程和分泌途径。该结果发表在《分子癌症》杂志上。

他们发现，抑制肿瘤的circRHOBTB3由癌细胞通过外泌体分泌，以维持大肠癌细胞的活性。此外，他们设计了针对circRHOBTB3的环状和分泌元件的反义寡核苷酸(ASOs)用于治疗CRC。

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Circbt3是宿主基因RHOBTB3转录后剪接环化产生的circRNA。RHOBTB3作为Rho GTP酶家族的一种ATP酶，参与膜转运[5，6]和蛋白酶体降解[7]。

先前的研究也表明circRHOBTB3在CRC、HCC和HCC中作为肿瘤抑制因子发挥作用。然而，其循环模式和外泌体分泌途径尚未得到解释。

首先，研究人员分析了来自GEO数据库的12名CRC患者、21名HCC患者、32名胰腺癌(PAAD)患者和14名健康供体的血清外来体的总RNA-seq数据。

结果显示，许多circRNAs在肿瘤患者血清外泌体中有不同程度的表达(图1A)，但在三种癌源的所有外泌体中，只有HSA _ CIRC HSA _ CIRC _ 0007444(circRHOBTB3)表达上调(图1B)，其宿主基因rhobtb 3在三种肿瘤组织中的表达与正常组织相比无明显增强(图1C)。

图1 irrchobtb 3在不同类型癌症患者血清外泌体中的表达

然而，对来自浙江大学医学院附属邵逸夫医院的18名CRC患者和16名健康供体的血清样本数据的分析显示，circRHOBTB3在CRC组织中显著下调，而宿主基因RHOBTB3与健康供体相比显著上调(图2中左二)。此外，在69个CRC组织样本中检测到的肝硬化b3的表达显示，肝硬化b3水平较高的患者的总存活时间更好(图2中右起第一个)。

图2大肠癌患者血清外来体中irrhobtb3的表达

所以研究人员不禁假设circRHOBTB3有抗癌作用？

为了验证这一点，他们首先确定了CRC患者血清外来体中的肝硬化b3确实来源于肿瘤细胞而不是基质细胞(图3A)，并且在来自NCM460细胞(正常肠上皮细胞系)的外来体中肝硬化b3的水平最低(图3B)。此外，circRHOBTB3在RKO和HCT116细胞(CRC细胞系)中过表达或被敲除。结果表明circRHOBTB3能抑制细胞迁移和侵袭(图3C)。

图3 circrhobtb 3来源和功能的体外验证实验

此外，他们通过分析RNA-Seq数据和RT-qPCR验证发现，与代谢、增殖和上皮间质转化(EMT)途径相关的基因在肝硬化btb3敲除/再表达细胞系中显著上调，而肝硬化btb3的再表达降低了这些基因的表达。此外，circRHOBTB3敲除细胞系中的ROS水平也显著增加。

他们还发现circRHOBTB3的结合蛋白是ENO1和ENO2。也就是说，circRHOBTB3可能通过与ENO1、ENO2等代谢酶相互作用，调节细胞内ROS水平，抑制肿瘤细胞增殖和EMT。

为了在体内验证肝硬化b3的功能，研究人员将过表达肝硬化b3的HCT116细胞(CRC细胞系)注射到裸鼠皮下，建立了异种移植瘤模型。发现与不表达肝硬化b3的对照(EV)组相比，肝硬化b3过表达(circhrohbtb 3-OE)组的肿瘤体积和重量明显更小，细胞增殖能力更弱(图4A，b，c)。

然而，当他们在裸鼠的脾脏接种实验中观察肝转移表型时，发现circRHOBTB3-OE组的肝转移少于EV组(图4D，E)。更有趣的是，在异种移植小鼠的血浆和尿液中可以检测到circRHOBTB3，而在野生型小鼠的血浆和尿液中却检测不到。此外，circRHOBTb3-OE组血浆中的肝硬化B3水平高于EV组(图4F，G)。

图4 circrhobtb 3功能的体内验证实验

根据这些数据，研究人员推测CRC细胞必须通过外泌体分泌circRHOBTB3来维持肿瘤侵袭转移的特性。换句话说，CRC细胞具有特殊的解毒机制。

在随后的研究中，研究人员发现了肝硬化b3的环化机制，还发现肝硬化b3本身的顺式元件(141 240nt，141-165nt，216-240nt)可以通过外泌体调节肝硬化b3的分泌过程(图5)。

图5用截短的circRHOBTB3载体转染的细胞中circRHOBTB3外来体的分泌丰度

之前的研究发现，ESCRT-II亚复合物作为一种RNA结合复合物，可以将RNA分选成外来体[8]。在这项研究中，他们发现SNF8可以结合到肝硬化b3的141-240nt区域，并促进肝硬化b3分选到外泌体中并分泌到细胞外。他们将这一过程定义为肿瘤外来体的逃逸机制(图6)。

图6 SNF8敲除实验和外源性RIP实验

受上述研究结果的启发，研究人员设计了第二代ASOs，增加circRHOBTB3的环化，减少分泌，有望成为一种新的癌症治疗策略。

研究人员设计了三种第二代ASOs:一种靶向负性环化的元件(ASO-CIR: 266-290NT)和两种外泌体分泌型元件(ASO-EXO1: 141-165NT，ASO-EXO2: 216-240NT)(图7)。

通过实验，他们发现ASO-cir确实可以增加肝硬化b3的环化，但是肝硬化b3的分泌也会增加。在ASO-exo1和ASO-exo2中，只有ASO-exo2(以下简称aso-exo2)不仅增加了circRHOBTB3的细胞内水平，而且阻断了circRHOBTB3外泌体的分泌。因此，研究人员考虑进一步利用ASO-cir和ASO-exo研究其联合治疗结直肠癌的特异性和抗肿瘤效果。

图7第二代ASOs及其作用机理

研究人员验证了ASOs联合确实可以比ASO-cir和ASO-exo单独使用产生更多的细胞内肝硬化b3，小鼠实验结果也符合预期：ASO-cir联合ASO-exo确实可以显著增加肝硬化b3在原发性脾脏病变中的表达，显著降低肿瘤的恶病质，控制转移(图8)。

图8体外和体内ASOs实验

总的来说，研究结果阐明了circRHOBTB3调节细胞内ROS和代谢途径抑制CRC进展的机制，也提出了新的肿瘤逃逸理论，即肿瘤细胞通过分泌抑制肿瘤的circRNA(肿瘤外泌体逃逸机制)维持癌细胞的活性。

更重要的是，他们设计的第二代ASOs可以通过靶向环化和分泌来调节肿瘤抑制circRNA，从而促进癌症的治疗效果。他们的临床数据显示，在结直肠癌患者中，85.7%(30/35)的肿瘤样本携带的肝硬化b3水平低于匹配的正常样本，并且肝硬化b3在肿瘤样本中的低表达与不良预后有关。这使我们相信，这种ASOs将成为未来大肠癌的一种有前途的治疗策略。

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