Cancer Cell丨毛开睿团队空间解析肿瘤抑制性免疫微环境

肿瘤基质部位形成Treg-mregDC-淋巴管生态位

利用多重免疫荧光技术和小鼠自发性肠道肿瘤模型（ApcMin/+小鼠），研究人员对肿瘤微环境中的主要免疫细胞亚群进行染色，发现大量的 Foxp3+Treg细胞特异性地聚集在肿瘤边缘的基质部淋巴管周围（图1）。对肿瘤中免疫细胞进行单细胞RNA测序（scRNAseq）分析，发现肿瘤中一部分Treg细胞呈现活化状态，并且与调节性成熟树突状细胞（mature dendritic cells enriched in immunoregulatory molecules, mregDCs）存在紧密关联。免疫荧光染色进一步验证了Treg与mregDC共同聚集在淋巴管周围，并且将此空间分布特征命名为Treg-mregDC-淋巴管生态位（图2）。

图1 Treg特异性聚集在肿瘤基质部淋巴管周围（Credit:Cancer Cell）

图2肿瘤基质部形成Treg-mregDC-淋巴管生态位（Credit:Cancer Cell）

Treg-mregDC-淋巴管生态位维持Treg细胞活化表型

scRNAseq数据揭示了 TME 中 Treg细胞活化状态存在异质性，其中一部分细胞呈现活化特征，而另一部分则维持静息状态。为了研究Treg活化表型与其空间分布特征之间的关联，研究人员使用PD-1 和 OX-40 以及 Foxp3来表征活化Treg，利用多重定量免疫荧光技术，揭示了 PD-1high和 OX-40highTreg在空间上与mregDC的紧密关系（图3）。同时，Nur77报告基因小鼠也表明Treg与mregDC在淋巴管周围的相互作用支撑了Treg在肿瘤微环境的局部活化。当利用MHC-II抗体阻断Treg与mregDC的相互作用后，Treg细胞表面活化相关分子（PD-1、CTLA-4、TIM-3、OX-40 和 ICOS）的表达水平下降。这些证据表明Treg 和 mregDC之间的互作促进并维持肿瘤微环境中Tregs的活化状态，从而增强其免疫抑制功能。

图3 mregDC促进并维持Treg细胞的活化表型（Credit:Cancer Cell）

阻断Treg-mregDC-淋巴管生态位的形成抑制肿瘤进展

Treg 和 mregDC 除了通过细胞膜表面分子直接接触外，mregDC还有可能通过分泌趋化因子CCL22/17将Treg招募到其周围。为了验证该趋化作用在Treg-mregDC-淋巴管生态位形成中的作用，研究人员将Ccl22tdTomato和Ccr4-/-Ubi-GFP骨髓细胞移植到辐照后的ApcMin/+小鼠中，构建了混合骨髓嵌合小鼠，发现CCR4缺失的Treg细胞无法准确定位到mregDC周围，因而也无法获得活化的表型特征。进一步，研究人员构建了ApcMin/+背景下Treg 特异性 CCR4 缺陷小鼠（ApcMin/+Foxp3CreCcr4fl/fl），当Treg 缺失CCR4后，小鼠肿瘤的生长也受到明显的抑制。这些结果表明 CCR4 介导了 Treg 迁移到mregDC周围，并通过与其相互作用获得活化表型，增强其免疫抑制功能，促进肿瘤免疫逃避。

Treg 抑制mregDC将肿瘤抗原携带到引流淋巴结，从而限制抗肿瘤免疫反应的起始

接下来，研究人员进一步探讨Treg如何在Treg-mregDC-淋巴管生态位中发挥抑制抗肿瘤免疫应答的功能。由于mregDC具备成熟活化和迁移特征（高表达CD80、 CD86和CCR7），其主要功能是携带肿瘤抗原迁移到引流淋巴结起始抗肿瘤免疫应答。因此研究人员通过在肿瘤原位注射荧光标记的卵清蛋白(FITC-OVA)以模拟肿瘤抗原，发现引流淋巴结中携带FITC-OVA的迁移性DC数量明显减少。当特异性清除Treg或阻断Treg与mregDC相互作用能明显增强肿瘤抗原向引流淋巴结的转运（图4），同时促进识别肿瘤免疫抗原T细胞在引流淋巴结中的增殖。进一步作者还发现清除Treg或阻断Treg与mregDC相互作用后，肿瘤中mregDC上CCR7、CD80和CD86表达水平显著上升，从而增强其携带肿瘤抗原到引流淋巴结的迁移。综上所述，TME中活化的Treg通过与mregDC的相互作用抑制肿瘤抗原到引流淋巴结的转运过程，阻碍抗肿瘤适应性免疫应答的起始，进而促进肿瘤的发生发展。

图4 Treg以CTLA-4依赖方式抑制肿瘤抗原到引流淋巴结的转运（Credit:Cancer Cell）

Treg与mregDC的互作也存在于人类中并导致不良预后

为了探究Treg与mregDC的相互作用是否也存在于人类肿瘤中，研究人员对已发表的结直肠癌的空间转录组数据进行深入分析，发现活化Treg和mregDC的特征基因也聚集性地分布在肿瘤基质的淋巴管周围，形成与ApcMin/+小鼠同样的 Treg-mregDC-淋巴管生态位。接下来，研究人员进一步评估了Treg和 mregDC之间的这种空间互作对肿瘤预后的影响，通过对TCGA 数据库进行分析，发现活化Treg特征基因表达水平低同时高表达mregDC特征基因（actTreglowmregDChigh）的具有显著的生存优势。这些结果与小鼠模型中的现象一致，表明Treg 和 mregDC 在肿瘤淋巴管周围的互作构成了阻碍抗肿瘤免疫应答的抑制性免疫微环境，从而降低患者生存率。

总的来说，这项研究揭示了肿瘤抑制性免疫微环境的空间组织结构、驱动其形成的分子机制及其相应的生理功能（图5）。这不仅加深了我们对肿瘤免疫逃逸的理解，还为肿瘤免疫干预提供了新的策略。

图5 Treg-mregDC-lymphatic生态位抑制抗肿瘤免疫应答（Credit:Cancer Cell）