Nat Chem Biol丨实现小鼠体内Cas9难编辑位点的高效编辑!杨辉/张海南/黄锦海团队开发出靶向更广的微型碱基编辑器

CRISPR/Cas9系统自发现以来，得到快速发展已被广泛应用生命科学基础研究、基因治疗、动植物育种改良等领域【1】。基于Cas9切口酶（nCas9）与脱氨酶结构域/糖基化酶（MPG或UNG）的融合成的碱基编辑器（ABE，CBE，gGBE，gTBE），可高效实现A-to-G，C-to-T，C-to-G，G-to-C/T，以及T-to-G/C的碱基替换，为纠正突变的疾病位点提供了高效基因编辑工具【2-6】。然而由于Cas9的体积过大（1368个氨基酸），基于nCas9的碱基编辑器难以实现单个AAV（4.7kb)的包装递送，极大限制了在体基因编辑的发展应用。近年来一系列紧凑型的Cas9蛋白【7-9】、Cas12f系列同源物【10-14】、以及其祖先蛋白TnpB【15,16】被报道，由于编辑活性有限，或缺乏HNH结构域而难以改造为缺口酶，都限制用于碱基编辑器的开发。2021年，张锋团队发现由IS200/IS605转座子超家族编码的IscB核酸酶，被认为Cas9的祖先蛋白，具有与Cas9相似的HNH和RuvC结构域，且仅有约500个氨基酸（约SpCas9的1/3大小）【17,18】，具有开发成微型碱基编辑器的潜力。

2023年，杨辉团队通过对OgeuIscB/ RNA系统的工程化改造，开发出了高效的OgeuIscB变体（enOgeuIscB），并通过融合脱氨酶结构域，开发出高效迷你型碱基编辑器（miBE），推动了DNA单碱基编辑领域进入迷你型的 新时代 ，具有极大的临床应用潜力【19】。然而，IscB/ RNA系统需要严格的6位碱基靶序列邻近基序（TAM）来识别目标DNA，识别位点有限。因此，开发靶标识别范围更广的高效小型IscB碱基编辑器是十分必要。

2024年8月15日，辉大（上海）生物科技有限公司研发团队、复旦大学附属眼耳鼻喉科医院黄锦海团队和中科院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉团队合作在Nature Chemical Biology上发表题为Engineered IscB RNA system with expanded target range for base editing的研究论文。该研究通过宏基因组数据挖掘，鉴定出19种具有不同TAM范围的新型IscB- RNA系统；综合RNA结构优化、蛋白质工程化改造、流式细胞术、脱靶检测等技术手段，成功获得在人类细胞内具有靶标识别范围广、更高效编辑活性的IscB系统（IscB.m16*）；通过融合脱氨酶结构域，进一步开发出基于新型IscB的迷你型腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器，并在哺乳动物细胞和小鼠疾病模型中包括SpCas9-BE无活性的疾病位点上均验证了其强大的碱基编辑效率和广泛的靶标识别能力，为未来精准基因治疗临床应用提供了强有力支持。