Cell子刊：诺奖团队揭开CRISPR基因编辑效率之谜

来源：生物世界 2025-04-28 16:49

这项研究颠覆了“PAM 越宽松越好”的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。

CRISPR-Cas9被誉为 基因魔剪 ，但其编辑效率在不同场景下差异巨大。为何有些 Cas9 变体能高效编辑，而另一些却频频 失手 ？

近日，Molecular Cell期刊发表了最新研究揭示了背后的核心机，这项由诺奖得主Jennifer Doudna教授（博士后史弘略为论文第一作者）领衔的研究，究揭示了广泛 PAM 识别与基因组编辑效率之间的基本权衡，提出了高效的 RNA 引导的基因组编辑依赖于优化的两步靶标捕获过程，其中选择性但低亲和力的 PAM 结合优先于快速的 DNA 解旋。这不仅解开了 CRISPR-Cas9 基因编辑效率密码，还为设计更有效的 CRISPR-Cas 及相关 RNA 引导的基因组编辑器奠定了基础。

这些发现也为长期以来关于 CRISPR-Cas9 基因编辑 是否要牺牲效率换取广谱性 的争议画上了句号。

Cas9 的 两步走 策略

就像快递员通过邮编和门牌号投递，Cas9 通过两步精准定位 DNA 靶点：

1、PAM识别：Cas9 首先识别目标 DNA 上的 PAM 序列（例如 NGG），锁定目标区域；

2、DNA解旋：随后解开 DNA 双螺旋，让 gRNA 与靶序列配对，形成 R-loop 结构并切割 DNA 双链。

关键发现：野生型 Cas9 与的 PAM 序列结合 快而松 快速扫描大量非目标位点后迅速释放，一旦找到正确靶点则高效解旋。这种 点到即止 的策略，使其在复杂基因组中游刃有余。

宽松版 Cas9 的 效率陷阱

为扩大 Cas9 可靶向编辑的范围，科学家开发了 Cas9 变体 SpRY，这种宽松版 Cas9（PAM-relaxed Cas9）可识别几乎任何 PAM 序列，但这类工具却存在严重缺陷：

陷入 温柔陷阱 ：SpRY 与非目标 DNA 结合更紧密，在错误位点反复停留，犹如陷入泥潭；

解旋速度减慢：即使找到正确靶点，其解旋效率仅为野生型 Cas9 的1/3；

敌我不分：竞争实验显示，SpRY 在非目标 DNA 存在时效率暴跌 200 倍，而野生型几乎不受影响。

研究团队通过单分子追踪技术（AuRBT）首次捕捉到动态过程：SpRY 在靶点处反复尝试解旋却频频失败，而野生型 Cas9 则 一气呵成 。这种 卡壳 现象源于其过强的初始结合力，导致能量屏障升高。

设计新思路：平衡 搜索 与 剪切

研究提出基因编辑器优化法则：

1、弱化非特异性结合：避免工具酶被 无效位点 困住；

2、加速靶点解旋：通过设计突变，降低 DNA 解旋能量壁垒；

3、两步协同优化：在 PAM 识别与解旋速度间寻找最佳平衡点。

突破性验证：在靶点旁引入 DNA气泡 （削弱双螺旋稳定性），SpRY 效率瞬间恢复至野生型 Cas9 水平，印证了能量壁垒理论。

未来展望

这项研究颠覆了 PAM 越宽松越好 的传统认知，揭示特异性与效率的精准平衡才是关键。基于此，科学家可重新设计 Cas9 变体：

开发 智能扫描 工具，在扩展靶点范围的同时保持高速搜索；

优化古细菌来源的IscB/TnpB等新型编辑器，突破现有技术瓶颈；

助力遗传病治疗、作物改良等应用，让基因编辑更安全高效。

研究团队表示，这项研究提示我们，不应该盲目追求去 PAM 化，未来基因编辑工具应构建一个多样化的 PAM工具箱 ，为不同临床或科研需求选择合适的 Cas9 变体，而非妄图发出一个万能工具。

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