Bio-Protocol：北京妇产医院刘朝晖团队成功构建“内膜外翻”的人子宫内膜类器官（含详细操作步骤）

实验步骤包括：组织获取与消化（步骤A）、3D类器官建立（步骤B）、扩增与质控（步骤C-E）、激素周期模拟（步骤F）、极性反转（AO-EO）（步骤G）、细菌感染模型（步骤H）。

实验步骤

步骤A. 子宫内膜组织分离和消化（1-14）

1. 预先准备10个100 mm培养皿，用于清洗子宫内膜组织。

2. 制备含抗生素的PBS：每10 mL PBS加入4 L 10 M Y-27632与100 L 100 抗细菌-抗真菌溶液（终浓度：青霉素100 U/mL、链霉素0.1 mg/mL、两性霉素B 0.25 g/mL）。每皿用10 mL该PBS冲洗内膜组织。所有操作在生物安全柜完成。

注意：组织样本最好应在同一天进行分离处理。如果无法立即处理，可以将其在4℃下保存过夜以保持活性。

3. 冲洗时轻摇组织以去除血块与碎屑，共洗10次（图1A）。

图1 组织分离、消化和培养过程中子宫内膜类器官的形态。(A)PBS清洗后子宫内膜组织形态的代表性图像。(B)培养第1、3、5和7天的子宫内膜类器官的明场图像。(C)传代后第P1、P3、P5和P7的子宫内膜类器官的明场图像。

4. 将洗净组织转入DMEM/F12培养基，待下一步。

5. 用灭菌镊子将组织剪成约0.1 cm小块。

6. 把剪碎组织移入50 mL无菌离心管。

7. 将组织在4℃下以100 g的速度离心5分钟。

8. 使用移液管小心地弃去上清液，不要扰动组织沉淀物。

注意：在消化前，彻底清洗组织以去除血块。不彻底的清洁可能会影响后续实验；确保在整个过程中子宫内膜组织始终保持在冰上，以保持细胞完整性和活力。

9. 向组织沉淀中加入3 mL酶消化液：胶原酶II与IV按1:1混合，终浓度各1 mg/mL。

10. 将混合物在37℃水浴中孵育30分钟。

11. 轻轻间歇性地搅拌混合物，确保组织与酶溶液均匀接触。

12. 30 min后加6 mL 37℃预热的DMEM/F12终止消化（体积为消化液2倍）。

13. 在4℃下以100 g离心混合物5分钟。

14. 小心弃去上清液，同时避免扰动沉淀物。组织现已准备好进行下一步处理。

步骤B. 类器官接种和建立（1-5）

1. 在子宫内膜组织分离消化后，使用血细胞计数器进行细胞计数。从培养中收获子宫内膜细胞，并在预冷至4℃的类器官培养培养基中重悬，浓度为每50 L基质胶含10,000个细胞。将悬液与基质胶混合，使最终基质胶浓度为70%。

2. 使用移液器将50 L的细胞悬液滴于24孔板，每孔3滴，总量50 L。

3. 将板置于37 C培养箱中，通入5%CO₂，倒置放置10分钟，然后正置放置20分钟，以促进类器官的形成。

4. 向每个孔中加入500 L预热（37 C）的子宫内膜类器官培养液。

5. 每三天更换一次子宫内膜类器官培养液，以维持类器官的最佳生长（图1B）。

注意：确保基质胶液滴均匀分布，以防止在孵育过程中合并；快速处理基质胶以保持其一致性，防止过早聚合；在初始孵育期间尽量减少对培养板的干扰，以确保正确的类器官形成。

步骤C. 类器官和类器官传代时的培养基更换（1-19）

1. 培养基与PBS使用前37℃预热。

2. 轻轻倾斜24孔板。

3. 使用1 mL的移液器尖端小心地吸出旧培养基，确保尖端不接触基质胶层。

4. 向每个孔中加入500 L预热后的PBS溶液，以清洗类器官，确保培养板保持水平。

5. 吸出并弃去PBS溶液。

6. 向每个孔中加入500 L 预热的新鲜类器官培养基。

7. 将培养皿放回37℃培养箱中继续培养。

8. 在子宫内膜类器官培养的第7天，用预热后的PBS清洗类器官一次。

9. 向每个孔中加入800 L的冷细胞回收溶液。

10. 用弯曲的10 L移液器尖端轻轻刮擦24孔板底部，以脱落基质胶层。

注意：对于留在底部的类器官，再次用冷细胞回收溶液清洗孔，以回收它们。

11. 用FBS冲洗吸管尖端以减少细胞损失，并将收集到的悬浮液转移至15 mL离心管中。

12. 将管子置于冰上，以80 rpm轻柔摇晃，在4℃下孵育1-1.5小时。

13. 在4 ℃下以100 g离心悬浮液5分钟。

14. 弃上清，用预冷的4 mL PBS溶液重悬沉淀物。

15. 再次以100 g离心5分钟，小心弃去上清液，同时将样品保持在4℃。

16. 将沉淀物重悬于200 L冷DMEM/F12中。

17. 将悬浮液上下吹打约30-80次以分离类器官。在显微镜下观察细胞团块的大小，当出现10-20个团块时停止吹打。

注意：检查是否有基质胶残留。如果仍有残留凝胶，用4 mL DMEM/F12溶液重复洗涤步骤，离心后弃上清。

18. 将最终沉淀物重悬于50 L的器官球培养培养基和基质胶混合物中，然后将50 L悬液转移至24孔板每个单孔中。

19. 将板在37 C、含5%CO₂的培养箱中孵育30分钟，以使类器官球建立。如果大部分类器官球保持完整，则进行下一次传代（图1C）。

注意：在移液过程中检测类器官完整性：i. 如果发生大量碎片化，向沉淀物中添加1 mL 的TrypLE。ii. 将悬浮液在37℃下孵育3分钟。iii. 用500 L的AdF12中和TrypLE。iv. 以100 g离心5分钟，弃去上清液，将沉淀物重悬于600 L AdF12中，再次以100 g离心5分钟，弃去上清液。

步骤D. 子宫内膜类器官的冷冻保存和解冻（1-14）

1. PBS预热至37℃。

2. 在子宫内膜类器官培养第8天，用预热后的PBS清洗类器官一次，以去除残留培养基。

3. 向每个24孔板孔中加入800 L冷细胞回收溶液。

4. 用弯曲的10 L移液器尖端轻轻刮取孔底，以分离基质胶。

5. 将分离的类器官收集到15 mL离心管中。如果类器官仍留在底部，再次用冷细胞回收溶液冲洗孔，并将液体转移到同一管中。

6. 用FBS冲洗吸管尖端，并将回收的悬浮液转移至离心管中。

7. 将管子放入4℃冰盒中，以80 rpm旋转1.5小时，使基质胶完全溶解。

8. 在4℃下以100 g离心5分钟。

9. 弃去上清液，用预冷的PBS洗涤沉淀物4 mL。

10. 在相同条件下再次离心，弃去上清液。

11. 用200 L冷DMEM/F12重悬沉淀物，并吹打50次以打散类器官。

12. 在显微镜下检查类器官，确保大部分保持完整，簇大小为20-30个细胞。类器官应比传代时使用的稍大。

13. 向重悬的类器官簇中加入1 mL冷冻保存液。

14. 将悬浮液转移至冷冻管中，并立即存放在-80℃冰箱中，以进行长期保存。

步骤E. 解冻子宫内膜类器官（1-17）

1. 从-80℃冰箱中取出一个冷冻管。

2. 立即将冷冻管放入37℃水浴中。

3. 轻轻摇晃瓶子，直至内容物完全解冻。

注意：避免长时间暴露在高温下，以减少细胞损伤。

4. 将解冻的类器官悬液转移至预冷的15 mL离心管中。

5. 缓慢加入5 mL预热后的类器官培养培养基，同时轻轻混合。

6. 在室温下以100 g离心5分钟，弃去上清液。

7. 保留含有类器官的沉淀物。

8. 加入2 mL预热的人体子宫内膜组织培养液，其中含有10 M Y-27632。

9. 轻轻上下吹打以重新悬浮类器官。

10. 在显微镜下观察，以确保类器官保持完整。

11. 将基质胶置于冰上预冷并液化。

12. 将类器官悬液与基质胶混合，终浓度为70%。

13. 将混合物用移液器吸取50 L，加入每个预温的24孔板中，每孔分为三个相等的基质胶液滴。确保每孔的总体积为50 L。

14. 翻转培养皿并在37℃下孵育10 min，然后将其放回直立位置，再孵育20分钟以完成完全聚合。

15. 缓慢向每个孔中加入500 L预温的类器官培养液。

16. 将板置于37℃、5%CO2培养箱中孵育。

17. 每3天更换新鲜类器官培养基以支持生长。

步骤F. 激素处理（1-8）

1. 在3天的建立期后，通过向每个孔中加入含有10 nM雌二醇（E2）培养基；每组3孔。

2. 对照孔500 L不含E2的培养基，培养天数与激素组相同。

3. 37℃、5%CO₂孵育3天。

4. 3天后小心吸弃培养基，勿扰动基质胶滴。

5. 加入含有10 nM E2和1 M孕酮（P4）的500 L类器官培养基。

注意：先用E2单独处理类器官3天，然后用E2+P4处理4天。

6. 将类器官37℃、5%CO₂继续孵育4天。

7. 每个条件用三个复孔进行实验以保证可重复性。

8. 每个条件再准备一个额外的第四个孔用于组织学分析。

步骤G. 外翻型子宫内膜类器官（AO-EO）的生成与增殖（1-10）

1. 吸出培养的子宫内膜类器官的生长培养基。

2. 向培养液中加入1 mL预冷至4℃的细胞回收溶液，以促进类器官的解离。

3. 使用宽口径1 mL移液管吸头，将类器官-细胞混合物转移至Ep管中。

4. 在4℃下使用细胞摇床以60 rpm轻轻旋转管子1小时，以实现完全解离。

5. 在室温下以100 g离心分离的类器官5分钟，使细胞沉淀。

6. 小心吸去上清液，用7 mL冷DMEM/F12洗涤沉淀，以去除任何残留的回收溶液；整个操作过程应在冰上进行。

7. 将洗涤后的类器官沉淀用5 mL类器官培养基重悬，以增强细胞存活并防止悬浮培养中的细胞凋亡。

8. 将重悬的类器官接种到超低粘附培养皿中，以促进顶端朝外子宫内膜类器官的形成。

9. 每天使用移液管轻轻晃动培养皿两次，以防止类器官聚集。

10. 每隔一天更换生长培养基，以维持类器官增殖和顶端朝外方向的理想条件（图2）。

图2 外翻型子宫内膜类器官的形成过程。（A）子宫内膜类器官外翻的过程：(a)外翻前，(b)外翻诱导后1.5小时，(c)1天，(d)2天，(e)4天，(f)6天。(B)子宫内膜类器官在外翻前后MUC1和ZO-1的免疫荧光染色。(a)子宫内膜类器官的MUC1染色；(b)外翻的子宫内膜类器官的MUC1染色；(c)子宫内膜类器官的ZO-1染色；(d)外翻的子宫内膜类器官的ZO-1染色。箭头指示MUC1和ZO-1的红色荧光信号。

步骤H. 类器官与细菌共培养（1-13）

1. 从北京妇产医院微生物实验室获取大肠杆菌（ATCC-25922）。

2. 将细菌菌株划线接种在LB琼脂平板上，37℃培养以形成菌落。

3. 从琼脂平板上挑取单菌落，接种到5 mL LB液体培养基中。

4. 将细菌培养物在37℃下以120 rpm的转速摇床培养，以促进细菌生长。

5. 使用分光光度计通过测定600 nm处的光密度（OD 600）来测量细菌浓度。

6. 确保细菌处于对数生长期，以最大化活性和感染性。

7. 调整细菌悬液，使感染MOI为1。每个类器官含有1 10^3个细胞，感染所需的细菌负荷为每个类器官1 10^3 CFU。通过将0.5 McFarland标准细菌溶液（1.0 10^8 CFU/mL）稀释到相应的培养基体积中，制备细菌悬液，以使最终细菌浓度达到每个类器官1.0 10^3 CFU。

8. 将制备好的AO-EO悬浮于器官球培养培养基中。

9. 在组织培养培养箱中将EO与细菌细胞混合。

10. 将共培养物在37℃下以40rpm旋转3小时，以促进细菌相互作用。

11. 孵育后，通过离心80 g，用10 mL的PBS冲洗类器官五次，去除多余的细菌细胞，以尽量减少非粘附细菌。

12. 将共培养的类器官在2 mL的新鲜类器官培养基中孵育24小时，进行恢复期。

13. 在预定的时间点，收集500 L的培养液上清液（图3）。

图3 子宫内膜类器官中的大肠杆菌感染。(A) 感染大肠杆菌后1小时和24小时的人子宫内膜类器官的明场图像。(B)比较感染大肠杆菌的人子宫内膜类器官与未感染对照组的炎症因子表达水平。

注意事项