PNAS：研讨提醒真核细胞维持DNA复制叉稳定的焦点机制

北京年夜学性命迷信学院孔道春试验室在美国迷信院期刊PNAS在线颁发了题为“The intra-S phase checkpoint directly regulates replication elongation to preserve the integrity of stalled replisomes” 的研讨论文。该研讨答复了过来50年在checkpoint（细胞周期测验点）调控维持真核细胞DNA 复制叉稳定畛域的两个焦点成绩：1）进展的DNA 复制叉为什么会不稳定，并倾向于垮塌；2）checkpoint调控维持进展复制叉稳定的焦点分子机制是什么？

正常细胞成长进程中，基因组不稳定次要是来自于DNA复制差错，年夜约2/3癌症的产生被以为是因为DNA复制差错招致的【Tomasetti Vogelstein(2015)， Science， 347： 78-81；Tomasetti et al. (2017)， Science， 355：1330-1334】，而DNA复制差错次要是来自于DNA复制叉的不稳定。DNA复制叉次要由两部门组成（图1）：Y字型的DNA构造和DNA复制体(Replisome)。DNA复制体包括一系列与复制相关的卵白质及卵白质复合物，此中，最紧张的是翻开双链DNA模板的CMG（Cdc45-MCM-GINS）解旋酶复合物，以及进行重生链DNA合成的DNA聚合酶——DNAPolα、δ、ε。正常挪动的DNA复制叉是绝对稳定的，DNA复制体中的CMG解旋酶与DNA聚合酶在物理及生化功效上慎密偶联。但当DNA复制叉遭逢复制阻碍进展上去时，进展的DNA复制叉被证实是不稳定的，倾向于垮塌。

上个世纪60年月末，研讨职员在裂殖里挑选到了一株渐变株，定名为rad3-136。很快发现rad3-136渐变株对羟基脲【Hydroxyurea (HU)， 克制dNTPs合成，招致DNA复制叉进展】高度敏感。至此，细胞维持进展DNA复制叉稳定的机制研讨拉开了尾声。Rad3及相关卵白介导的细胞调控，于1988年被定名为checkpoint调控【Weinert Hartwell(1988)， Science， 241：317-322】， Rad3被归类为ATR激酶。过来50年，前后上千个试验室，用两代人的光阴，颁发了上万篇研讨文章，证实checkpoint是维持进展DNA复制叉稳定的必须细胞调控。在checkpoint缺失或缺点的细胞，进展的DNA复制叉产生垮塌，招致DNA复制不克不及实现，以及基因组的极端不稳定。然则，研讨组在试图说明checkpoint调控维持DNA复制叉稳定的机制研讨方面，碰着了极年夜阻力，阻力次要是来自于checkpoint调控的靶卵白极难被确定，已颁发文章的论断也相互矛盾，招致checkpoint调控维持DNA复制叉稳定的焦点机制恒久得不到确定。

通过年夜规模的遗传挑选，孔道春试验室发现，复制解旋酶CMG（Cdc45-MCM- GINS）复合体的一个亚基Cdc45的渐变能极年夜下降（600-3000 倍）checkpoint通路缺点的细胞对HU 的敏理性，暗示Cdc45或CMG复合体能够被checkpoint调控。通过一系列及生化阐发，证实Rad3ATR-Cds1Chk2 checkpoint 通路间接调控DNA复制解旋酶CMG复合体。孔道春试验室发现：当DNA复制叉进展后，Cds1Chk2 同时磷酸化Cdc45 亚基上的三个丝氨酸残基（且这三个Chk2/Chk1 磷酸化位点在分歧物种中绝对激进）。这三个丝氨酸残基的磷酸化招致CMG复制解旋酶活性深度下降。CMG复制解旋酶活性的下降使得它不克不及脱离进展复制叉，不克不及与被阻拦的DNA 聚合酶离开。

如许，进展的DNA复制体（Replisome）及复制叉的生化完全性获得了维持，从而阻止了进展DNA 复制叉的垮塌。

为什么进展复制叉里的复制解旋酶与DNA聚合酶会倾向于离开呢？这联系关系到两件事情：一是DNA复制体或DNA复制叉的根本生化个性；二是正常细胞成长进程中招致复制叉进展的根本起因。DNA复制体中，DNA Pol ε担任合成前导链（leading strand）合成， DNA Polα和δ担任后随链（laggingstrand）合成。因为后随链的合成略微滞后于CMG解旋酶介导的DNA链解开，招致后随链的DNA模板上恒定的呈现一段约200核苷酸长度的单链DNA区域。要是该单链DNA区域无形成DNA二级构造的序列，如G4、三股链、发夹构造等，DNA二级构造的造成便是一个年夜概率变乱。造成的DNA二级构造会阻拦DNA Pol α、δ的挪动，招致复制叉进展。在细胞的染色体DNA上，年夜约有2000-4000个能造成DNA二级构造的序列。在人细胞中，能造成DNA二级构造的数量年夜约无数百万个（~75万个G4构造，及数倍于G4的三股链构造等）。是以，DNA二级构造招致的复制叉进展是一个常常产生的生物变乱。在前导链或后随链的DNA模板上，要是有碱基毁伤（每团体细胞天天有约105级其余这类毁伤）或化学修饰，也会阻拦DNA Polα、δ、ε（DNA聚合酶的活性中间十分精美，只能包容AT或GC配对，但不克不及包容AC或GT配对，以保障DNA复制的精准性），招致复制叉进展。当DNA聚合酶被阻拦后，CMG解旋酶还要往前挪动，如许就会招致CMG 解旋酶与DNA聚合酶物理上的离开，招致复制叉垮塌。

颠末上千个试验室50年的不懈尽力，checkpoint调控维持进展DNA复制叉稳定的焦点机制终极获得了说明。即，1）进展复制叉不稳定、倾向于垮塌的基本起因是：当DNA聚合酶被阻拦后，复制解旋酶与DNA聚合酶倾向于离开；2）checkpoint调控维持进展复制叉稳定的焦点机制是：下降复制解旋酶的活性，阻止复制解旋酶脱离复制叉或DNA聚合酶，维持两者之间在物理及生化功效上的慎密偶联，从而维持进展复制叉稳定，并坚持它的生物学功效（图2）。孔道春试验室于2019年发现的chromsfork调控，通过进步进展复制叉四周的染色质构造慎密水平，也是为了阻拦复制解旋酶脱离复制叉，以维持复制叉稳定。(100yiyao.com）