应用DNA甲基化追溯囊胚培育液中游离DNA细胞起源

人类的妊娠效率很低，自然妊娠中只有不到50%的胚胎可能发育至足月。部门流产胚胎次要是源于胚胎的非整倍体染色体异常，在移植胚胎前鉴定并扫除非整倍体胚胎是辅助生殖畛域面对的微小挑战。以后临床上多采取对植入前胚胎的滋养外胚层进行样品活检和遗传学检测的方式来阐发胚胎细胞的染色体倍性。该办法因波及侵入性的胚胎细胞活检，操作繁琐，无奈防止对胚胎形成一定水平的机器毁伤。以检测体外培育胚胎的培育液中游离DNA为代表的无创植入前胚胎学检测，因没有对胚胎自身进行取样操作，可能防止上述成绩，但无创检测的一个难点在于对培育液中游离DNA的细胞溯源，这间接关乎无创检测办法的检测精确性。

北京将来基因高精尖立异中间（ICG）、北京年夜学生物医学前沿立异中间（BIOPIC）、性命迷信学院汤富酬传授/文路副研讨员团队与北京年夜学第三病院乔杰传授/黄锦副主任医师团队单干在The Journal of Clinical Investigation杂志颁发题为“DNA methylome reveals cellular origin of cell-free DNA in spent medium of human preimplantation embryos”的研讨论文。该研讨对194例体外培育胚胎的培育液（spent embryo culture media，SECM）进行微量DNA甲基化组测序（Post–bisulfite adaptor tagging–based single-cell whole-genome DNA methylation sequencing， scBS-seq），通过和此前该团队单干颁发的植入前胚胎的单细胞DNA甲基化组图谱进行体系比拟阐发，鉴定了培育液中游离DNA（cell free DNA，cfDNA）的精确细胞起源，并在此根底上精准定量了培育液中的来自颗粒细胞的母源DNA净化，进而完成了体系的整合阐发（图1）。

胚胎培育液游离DNA中存在来自母体颗粒细胞的游离DNA净化

该研讨将培育液游离DNA的甲基化与植入前胚胎细胞和颗粒细胞基因组DNA的甲基化进行了体系的非监视阐发，发现50/191 SECM与颗粒细胞聚为一类，这些SECM出现较高的全基因组甲基化程度，与颗粒细胞的全基因组甲基化程度接近（图2A）。

为了进一步量化SECM中颗粒细胞净化起源的DNA比例，研讨鉴定了769个颗粒细胞特异高甲基化的差别甲基化区域（C-DMRs），这些差别甲基化区域在颗粒细胞中高度甲基化，而在植入前胚胎细胞基因组DNA中近乎零甲基化（图2B）。依据C-DMRs的甲基化程度，将分歧的SECM样品分为无颗粒细胞净化的样品、颗粒细胞中度净化的样品、颗粒细胞重度净化的样品三组，成果显示跟着颗粒细胞净化比例的添加，SECM样品的总体甲基化程度响应添加，标明SECM的总体甲基化程度高很年夜水平上是由颗粒细胞起源的游离DNA净化惹起的（图2C）。

胚胎培育液游离DNA中存在来自胚胎极体细胞的游离DNA净化

为了进一步探求无颗粒细胞净化的SECM中游离DNA的精确起源，该研讨持续将培育液游离DNA的甲基化与植入前胚胎细胞的基因组甲基化进行了体系的非监视聚类阐发，成果显示3/96 SECM与MII期卵细胞与雌原核的基因组DNA聚为一类（图3A）。因为胚胎在体外培育进程中仍在继续发育，是以卵细胞中雌原核的基因组DNA不会被开释到培育液中，据此推测胚胎培育液游离DNA的起源是排出胚胎外的极体细胞。

为了进一步量化SECM中净化的极体细胞游离DNA的比例，研讨鉴定了548个卵/极体细胞特异高甲基化的差别甲基化区域（O-DMRs），这些区域在卵细胞和雌原核中高度甲基化，而在植入前胚胎细胞以及颗粒细胞中低甲基化（图3B）。据文献报道，非CpG的甲基化程度在卵母细胞中显着高于其他植入前阶段的胚胎细胞。在无颗粒细胞净化的SECM中，CHG和CHH(非CpG)的甲基化程度与O-DMRs甲基化程度呈正相关，标明SECM中有时存在极体细胞净化（图3C）。

胚胎培育液游离DNA中母源DNA净化率的推导

应用769个C-DMRs和548个O-DMRs的甲基化程度数据，该研讨团队树立盘算办法推导了胚胎培育液游离DNA中颗粒细胞和极体细胞DNA组分的比例。起首，通过盘算机天生一系列掺入分歧比例的ICM/TE和颗粒细胞、极体细胞的模拟混合数据，再应用该盘算办法盘算颗粒细胞和极体细胞的百分比，发现盘算获得的比例与理论掺入的比例高度吻合，这标明该盘算办法的精确性很高（图4A）。

接着该研讨盘算了理论培育液游离DNA中各组分的比例，发现1/3的胚胎培育液游离DNA样本中存在颗粒细胞净化，且22%的样本颗粒细胞净化比例超过60%以上。1/3的胚胎培育液游离DNA样本存在极体细胞净化，4%的样本是极体净化超过60%以上。阐明通常环境下在胚胎培育液游离DNA中颗粒细胞净化比极体细胞净化更重大。

随后，该研讨界说了颗粒细胞和极体细胞净化比例之和为净母源净化，发现只有1/3的胚胎培育液游离DNA样品不存在显明的母源净化，快要1/3的胚胎培育液游离DNA样本存在重大的母源净化（图4B）。

胚胎培育液游离DNA母源净化与染色体非整倍性的整合阐发

DNA甲基化测序可以揣摸染色体拷贝数（CNV）的环境。该研讨在细胞系中评价了单细胞BS-seq揣摸拷贝数成果的精确性，发现单细胞BS-seq获得的拷贝数和用MALBAC获得的成果一致，同时所需的肇端量很低（图5A）。该研讨还探求了胚胎培育液游离DNA母源净化对揣摸胚胎细胞染色体拷贝数的影响。成果显示染色体拷贝数的性别纷歧致率和假阴性率均随颗粒细胞、极体细胞和母源净净化率的添加而添加。当净母源净化比例高于60%时，性别纷歧致率和假阴性率别离添加到100%和75%。是以，当母源重大净化时，由SECM揣摸的胚胎细胞的CNV就变得禁绝确。

综上所述，该研讨初次将胚胎培育液中游离DNA的细胞起源追溯到囊胚细胞、颗粒细胞和极体细胞，而且开辟了疾速便捷定量胚胎培育液游离DNA中母源净化量的算法，同时通过母源净化和染色体非整倍性的整合阐发，进步了应用胚胎培育液检测非整倍体胚胎的检测效率。该研讨对表征胚胎培育液中游离DNA提供了新见解，为无创植入前胚胎非整倍体学检测（PGT-A）提供了新的视角。(100yiyao.com）