科学:利用CRISPRa和CRISPRi揭示对人类T细胞功能重要的基因

2022年2月6日/Bion/-CRISPR基因组编辑已成为消除或改变DNA序列并研究其结果的有力工具。现在，在一项新的研究中，来自格拉德斯通研究所和加州大学旧金山分校的研究人员使用CRISPR-Cas9系统来强制激活人类免疫细胞中的基因，而不是编辑它们。这种方法被称为CRISPR激活(CRISPR Activation，CRISPRa RA)，使他们能够比以前更彻底、更迅速地发现在免疫中起作用的基因。相关研究成果发表在2022年2月4日的《科学》杂志上，标题为“Crispr激活和干扰筛选人类原代T细胞的解构反应”。

通讯作者、加州大学旧金山分校基因组研究所所长亚历克斯马森博士说，“这是一个令人兴奋的突破，将加速免疫治疗的研究。这些CRISPRa实验为了解哪些基因对免疫细胞的每项功能都很重要提供了可靠的线索。反过来，这将让我们对如何从根本上改变免疫细胞有一个新的认识，让它们成为治疗癌症和性疾病的一种方式。”

该研究是CRISPRa首次成功应用于直接从人体大规模分离的原代人免疫细胞。这些作者在不同的免疫细胞中激活了基因组中的每个基因，使他们能够并行测试近20，000个基因。这使他们能够快速理解哪些规则为重新编程细胞功能提供了最强大的杠杆，这可能最终导致更强大的免疫疗法。

新的CRISPR

CRISPR-Cas9基因组编辑系统通常依靠被称为“分子剪刀”的Cas9蛋白将DNA剪切到基因组的理想位置。

近年来，Marson和他的同事利用CRISPR分子剪刀，选择性地去除或敲除包括调节性T细胞和单核细胞在内的各种类型人类免疫细胞的基因。他们的研究结果已经开始阐明如何通过基因改造免疫细胞来更有效地对抗感染、炎症或癌症。然而，他的团队知道他们仍然错过了故事的一部分。

该论文的合著者、马森实验室博士后学者扎卡里施泰因哈特博士说：“敲除基因对于理解免疫细胞的基本功能非常有用，但是只敲除基因的方法可能会漏掉一些真正关键的基因。”特别是，剔除一个基因并不能告诉你如果你让它更活跃会发生什么。

全基因组CRISPR RA/I筛查发现了可调节的调节因子，可刺激人原代T细胞产生反应性细胞因子。图片来自science，2022，doi :10.1126/science . abj 4008。

因此，这些作者采用了CRISPRa。在CRISPRa中，Cas9蛋白经过基因改造后不再能切割DNA。相反，科学家可以在Cas9上附着一种活化剂——一种分子“开关”，这样当它与基因结合时，就可以激活基因。或者，他们可以在Cas9上连接一个抑制剂——一个“关闭”开关，以关闭一个基因，并获得类似于典型基因敲除方法的结果，这被称为CRISPR干扰(CRISPR interference)。

绘制T细胞基因图谱

作为免疫细胞，T细胞是人体免疫的关键介质之一。它们不仅针对入侵的病原体，还指示其他免疫细胞增加或减少对入侵者或癌细胞的反应。这种信息传递是通过产生称为细胞因子的信号分子来实现的。不同类型的T细胞产生不同的细胞因子组合，不同的细胞因子或细胞因子组合对免疫反应有不同的影响。

Marson说，控制T细胞产生的细胞因子将为在不同疾病环境中重塑整体免疫反应提供新的机会。然而，人们对哪些基因控制哪些细胞因子的产生的理解是不完整的。

在这项新的研究中，该论文的共同第一作者马森、施泰因哈特和拉尔夫施密特博士以及他们的同事共同努力，使Crispri和CRISPRi在原代T细胞中发挥有效作用——这是以前从未做过的事情。

Marson说，“这种提高的将crispri或CRISPRi复合物递送到细胞中的效率对于实现全基因组实验和加速发现非常重要。”

这些作者随后使用这些方法激活或抑制了直接从几名健康志愿者分离的人类T细胞中的近20，000个基因。他们对产生的细胞进行了筛选，以了解细胞因子产生的变化，并针对数百个充当关键细胞因子调节因子的基因，包括一些以前在基因敲除筛选中从未发现的基因。

施密特说，“我们的研究证明了这项技术在人类T细胞中的准确性和可扩展性。我们很快了解到你可以打开哪些基因来调节某些细胞因子的水平。”

更好的T细胞疗法

为了治疗某些类型的癌症，临床医生越来越多地使用CAR-T细胞疗法，即从患者体内取出T细胞，在实验室中对其进行基因修饰，使其靶向癌细胞，然后将这些基因修饰的T细胞再注入同一患者体内。通过改变T细胞的细胞因子产生来提高T细胞的抗癌能力，CAR-T细胞疗法可以更加强大。

马森说，“我们的新数据为我们提供了极其丰富的关于T细胞的指导手册。现在我们有了一种基本的分子语言，可以用来对T细胞进行基因改造，使其具有非常精确的特性。”