Circulation:揭示心脏损伤修复中冠状动脉的新来源和形成过程

冠心病一直是全人类死亡率最高的疾病之一。冠状动脉一旦病变，就会阻碍血液向心肌的有效流动，导致心肌缺乏必要的氧气和营养物质，从而引起。如何使病变的冠状动脉重新发挥血流的作用(血运重建)或刺激新冠状动脉的形成，一直是该领域研究者努力的方向。随着支架植入和冠状动脉旁路移植术的发展，血运重建成为可能，并挽救了一些患者的生命。侧支动脉的形成为新梗塞的心脏提供了血流，从而缓解了心力衰竭。但也有一定数量的患者由于身体原因无法接受血运重建的治疗，侧支动脉的形成仍然受到新生的限制。因此，深入探索新生冠状动脉的起源和形成机制，将为心脏损伤后血管的修复和再生提供新的策略或方法。

目前，关于侧支动脉新生有两种解释模型。一种是动脉发生，即先存动脉通过快速的管腔开放和血管壁增厚产生侧支动脉(Helisch A等，微循环2003)；另一种是动脉化，其中毛细血管通过血管生成进行重塑，并招募周细胞和平滑肌细胞来产生侧支动脉(费伯JE等人，Arteriosler Thrombvasc Biol 2014)。鉴于成人心肌梗死过程中很少观察到毛细血管通过动脉化生成的冠状动脉(何等，Cardiovasc Res 2016)，目前的主流观点更倾向于用血管新生模型来解释新生冠状动脉。然而，随着技术的发展，冠状动脉再生的方式仍需进一步研究。

为了灵敏、干净地检测来自毛细血管的动脉，基于双同源重组酶介导的谱系追踪技术(何等，Nature Medicine 2017)，研究人员建立了一种无缝捕捉毛细血管化的新系统。以前的研究难以捕捉成人毛细血管动脉化过程的原因是有两个障碍。首先，作为毛细血管分子标记物的Apln仅在一些新生血管毛细血管中有活性，而在成人心脏的动脉内皮细胞中没有活性，这使得有效标记成人心脏中的毛细血管内皮细胞成为一个技术问题。其次，如果单纯的对毛细血管进行标记，想要在无数的毛细血管中找到几条毛细血管动脉化导致的动脉，无异于大海捞针。这种低分辨率的方法很容易让研究人员忽略毛细血管化导致的动脉。为了克服上述障碍，周斌的研究小组使用了三种小鼠品系，Cdh5-DreER，Apln-CrexER和Cx40-LSL-GFP，建立了一个仅标记来自小鼠心脏毛细血管的动脉的系统。Cdh5-DreER是内皮特异性小鼠品系，Apln-CrexER是毛细血管特异性小鼠品系，Cx40-LSL-GFP可以将动脉标记为绿色。在三苯氧胺的诱导下，Cdh5-DreER的DreER会进入细胞核，apln-creer的rox-ER-rox会被切断，使Apln-Creer变成持续表达Apln-Cre，而一旦表达Apln的细胞中的Cx40基因被激活，Apln-Cre的Cre就会进入细胞核。Cx40-LSL-GFP的loxP-stop-loxP被切掉，使细胞呈亮绿色，即表达Apln的毛细血管演变成动脉(表达Cx40)并用绿色标出(图A)。该系统通过将Apln-CrexER改为Apln-Cre，突破了Apln-CreER只能标记成人心脏新生毛细血管的限制，同时保留了三苯氧胺作为诱导事件通过Cdh5-DreER的优势。其次，研究人员引入Cx40-LSL-GFP作为报告基因，将荧光标记限定在表达Cx40的动脉上，这样就只能看到来源于毛细血管的动脉，克服了标记所有毛细血管的缺陷。利用这个敏感而清晰的系统，研究人员期望记录下心脏损伤过程中毛细血管动脉化产生动脉的所有事件。

为了测试该系统是否符合预期，研究人员基于新生期仍发生毛细血管动脉化的现有知识，研究了新生期Cdh5-DreER。apln-crex er；实验在Cx40-LSL-GFP小鼠中进行。研究人员在p0天给三基因小鼠注射他莫昔芬，在p2天对小鼠进行心肌缺血(MI)手术，并在p6天收集小鼠的心脏进行分析(图B)。全组织荧光照片结果显示，心肌梗死后有清晰的GFP侧支动脉形成，心肌梗死组的侧支动脉数量多于未损伤组。通过荧光染色，平滑肌标记物aSMA和GFP共染色，证实GFP阳性细胞均被aSMA包裹，表明毛细动脉化形成侧支动脉(图B)。上述结果不仅表明该系统可用于追踪毛细血管动脉化产生的新动脉，而且揭示了新生心脏损伤修复过程中毛细血管内皮细胞对侧支动脉贡献的重要生物学过程。

为了探索在成人受伤的情况下毛细血管的动脉化产生动脉，研究人员研究了8周大的Cdh5-DreER。apln-crex er；给具有Cx40-LSL-GFP基因型的小鼠注射他莫昔芬。为了避免他莫昔芬残留对实验结果的影响，研究人员在注射他莫昔芬两周之后对小鼠进行了心肌梗死手术(图C)。为了探索不同类型心肌梗死中毛细血管的动脉化，研究人员介绍了三种心肌梗死模型，包括主动脉弓缩窄(TAC)、心肌缺血再灌注(MI/R)和心肌缺血(MI)。全组织荧光照片结果显示，在TAC和MI/R心肌梗死模型中几乎看不到GFP阳性信号，但在MI后可以看到明显的GFP阳性血管形态(图C)。为了详细查明GFP阳性细胞是否是动脉内皮细胞，研究人员分别对从三种心肌梗死模型中获得的心脏组织切片进行染色，并通过免疫荧光染色将GFP与aSMA、SM22和SM-MHC标记物共染色。结果显示，MI后的GFP阳性细胞确实被aSMA、SM22和SM-MHC阳性平滑肌细胞包裹，这证实了来源于毛细血管的GFP阳性细胞是动脉内皮细胞(图D)。此外，在TAC和MI/R模型下获得的心脏样本被连续切片，但是没有检测到GFP信号。为了排除这两种模型下系统效率低下的可能，研究人员引入了R26-LSL-tdTomato小鼠，测试了CD H5-DreER；apln-crex er；cx40-LSL-GFP；R26-LSL-tdTomato进行TAC或MI/R，收集其心脏样本进行切片染色，发现大量tdTomato信号(图E)。结果表明，Cdh5-DreER能有效地切断Apln-CrexER的rox-ER-rox，使Apln-Cre能进一步切断R26-LSL-tdTomato。因此，研究人员得出结论，在TAC或MI/R心肌梗死模型中没有检测到GFP阳性的动脉内皮细胞，不是因为系统效率，而是因为心脏的缺血程度不足以刺激这两种损伤模型中毛细血管化的发生。换句话说，在严重MI心肌梗死模型中，存在毛细血管化以产生新的冠状动脉。

综上所述，团队在实验室建立的双同源重组酶介导的谱系追踪技术基础上，开发出了更加灵敏清晰的系统，实现了在成人损伤情况下追踪毛细血管化产生的动脉的目的。本研究结果丰富了成人损伤条件下新生动脉起源的知识，为心脏损伤后的血管修复和再生提供了新思路。

卓越细胞中心揭示心脏损伤修复中冠状动脉的新来源和形成过程