细胞子课题:上海科技大学季全江团队研发高效迷你CRISPR

来源：生物世界2022-09-30 08336007

CRISPR-Cas系统是目前最常用的基因编辑工具，但由于传统Cas核酸酶分子量大，其在体内基因治疗中的应用受到限制。

上海科技大学季全江教授发表了一篇研究论文，题为：引导RNA工程在细胞报告中使用微型综合征棕榈CAS核酸酶实现高效的清晰编辑。

本文报道了来自棕榈同养单胞菌的Cas12f1(SpaCas12f1)的生化特性和DNA切割机制，证明了CRISPR-SpaCas12f1系统在细菌中可以实现多种编辑目的，通过工程RNA可以将其转化为哺乳动物细胞中高效的基因组编辑器。

CRISPR-Cas系统是目前最常用的基因编辑工具，但由于传统Cas核酸酶分子量大，其在体内基因治疗中的应用受到限制。

近年来，为了解决这一问题，小Cas核酸酶逐渐被发现和探索。其中，Cas12f核酸酶是目前最紧凑的CRISPR效应器核酸酶，比传统的Cas9和Cas12a核酸酶小一半以上，在临床治疗应用方面潜力巨大。然而，高效的Cas12f基因编辑系统仍然很少。

2021年9月，季全江团队在《自然化学生物学》杂志上发表了一篇题为《一个最小的crispr-CAS 12 F核进行程序化基因组编辑》的研究论文。系统表征了一个非常小的CRISPR核酸酶AsCas12f1(只有422个氨基酸)的DNA识别和切割机制，并探索了其作为新的基因编辑工具的可能性，成功实现了细菌和哺乳动物细胞中的高效基因编辑。

在这篇细胞报告论文中，季全江团队从棕榈合成单胞菌(Syntrophomonas palmitatica)中发现了紧凑的SpaCas12f1，它只有497个氨基酸。本研究首次系统表征了SpaCas12f1的生化特性和DNA识别切割模式。证明SpaCas12f1是一种镁离子依赖的嗜热核酸酶，在tracrRNA和crRNA的帮助下，能有效切割含有5 -NTTY(Y代表C或T)PAM的双链DNA。此外，SpaCas12f1的切割模式与AsCas12f1相似，即在靶向链中引入一个切口，在非靶向链中引入两个切口。

CRISPR-SpaCas12f1的鉴定和转化

由于SpaCas12f1在大肠杆菌中具有质粒干扰活性，为了探索其能否成为细菌中高效的基因组编辑工具，研究团队引入了SpaCas12f1和Lambda Red重组酶系统以及单链修复模板，实现了CRISPR-SpaCas12f1在大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中的基因组编辑。

同时，研究团队发现SpaCas12f1的tracrRNA具有独特的从头到脚的发夹结构，这是限制SpaCas12f1在哺乳动物细胞中有效编辑的主要因素。通过对RNA二级结构的预测和对小RNA测序结果的分析，研究团队设计了五种策略，对指导RNA进行了系统工程化，成功获得了一种高效的指导RNA——gRNA _ MS13，从而实现了对哺乳动物细胞的CRISPR-SpaCas12f1高效编辑。

本研究扩充了micro CRISPR核酸酶工具库，为micro CRISPR系统的基因治疗和工程化提供了新的思路。

上海科技大学季全江团队博士生王玉珏为第一作者，上海科技大学季全江教授、吴兆洛助理研究员为论文合著者。本研究得到了临港杰出青年实验室、杰出青年基金委员会、面上项目、上海市科委原创探索项目等基金的资助。

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