核酸研究:揭示线粒体tRNA选择性降解导致HUPRA综合征的分子机制

中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)的周小龙研究员和上海儿童医学中心的王健研究员合作，选择了降解trnaser (AGY)是线粒体丝氨酸-trna合成相关疾病的主要驱动因素，在《核酸研究》杂志上在线发表了最新的研究成果。

哺乳动物细胞有两个蛋白质合成系统，即细胞质和线粒体蛋白质合成系统。人类线粒体基因组包含37个基因，包括2个rRNA (12S和16S)，22个tRNA和13个蛋白编码基因。线粒体翻译机器的所有核酸成分(mRNA、rRNA、tRNA)均由线粒体基因组编码，所有蛋白质成分均由核基因编码。在细胞质中合成后，通过线粒体定位信号肽转运到线粒体中发挥功能。线粒体蛋白质合成只产生线粒体基因组编码的13种蛋白质，这些蛋白质都是线粒体氧化磷酸化复合物I、III、IV、V的核心亚基，而且都是跨膜蛋白，对氧化磷酸化复合物的组装和功能起着至关重要的作用。线粒体蛋白质合成的速率和保真度直接控制线粒体遗传信息传递的准确性、氧化呼吸链复合物的正确组装和功能，进而控制线粒体代谢和生命细胞活动。

线粒体氨酰tRNA合成酶(mt-aaRS)是蛋白质合成的关键因子。催化线粒体tRNA的氨酰化反应，为线粒体内蛋白质的合成提供原料。Mt-aaRS基因突变可导致常染色体隐性遗传病，其临床表型以中枢神经系统受累最为明显，也可累及肌肉、心脏等组织器官。此类疾病往往临床困难，发病机制不明，治疗手段极其有限，急需深入研究。

线粒体丝氨酰tRNA合成酶(SARS2)催化两种线粒体trnaser[hmtRNASer(AGY)和hmtRNASer(UCN)]的氨酰化。需要指出的是，hmtrnaser (AGY)是人类细胞中唯一没有倒L型三级结构的trna，这是由于它缺乏D-茎/环结构。目前，基因突变的病例非常罕见。据报道，患者的表型主要分为两类。一种是致命的HUPRA综合征，其特征是高尿酸血症、肺动脉高压、肾衰竭和碱中毒。另一类主要表现为进行性痉挛性四肢瘫。

本研究报告了一例SARS-2基因突变患者，其主要表现为肺动脉高压、运动发育迟缓、反复发作、脑萎缩等。该患者的表型与已知的SARS-2基因突变引起的疾病既重叠又不同。全外显子测序分析显示，SARS2基因存在复杂的杂合突变，包括非经典剪接位点突变(c.654-14T A)和移码突变(c.1519dupC)，为新发现的突变。C.654-14T A导致内含子区保留12个碱基，导致SARS2的活性中心插入4个氨基酸(该突变体命名为Ins12)，而c.1519dupC突变导致SARS 2的C端缺失和异常延伸，替换了关键的C端tRNA结合域(该突变体命名为dupC)。

研究(1)用生化方法详细研究了SARS-2突变体对SARS-2氨基酸活化、氨酰化和tRNA结合能力的影响。发现INS-12不能催化两个线粒体tRNA酶的氨酰化，但能激活Ser并结合tRNA，说明活性中心4个氨基酸的插入不能正确引导tRNA的CCA末端到催化活性位点。然而，dupC对两种线粒体trna酶的氨酰化活性明显受损。同时，dupC对两种线粒体trnas的亲和力被显著破坏，这表明SARS2蛋白的c端对trnas的结合非常重要。(2)用结构生物学方法分析比较了野生型SARS-2和INS-12的结构特征，并结合折叠结构模拟，揭示了INS-12突变体活性中心插入4个氨基酸破坏了SARS-2的二聚化能力。(3)通过建立多诱导多能模型，揭示了hmtRNASer(AGY)在患者来源细胞中的稳态水平显著下降，hmtRNASer(UCN)不受影响，提示hmtRNASer(AGY)的氨酰化缺陷导致hmtRNASer(AGY)更容易降解；此外，SARS2还可以作为tRNA的分子伴侣，它可以通过与缺乏D茎/环的hmtRNASer(AGY)结合来稳定结构。酰化hmtRNASer(AGY)含量不足进一步导致患者线粒体翻译系统显著下调，并导致线粒体呼吸链氧化磷酸化能力不足，糖酵解过程异常，细胞内活性氧异常增加，凋亡水平升高，线粒体主动自噬和线粒体动态平衡失衡，导致线粒体稳态失衡和功能障碍。(4)通过构建Ins12和dupC小鼠模型，发现这两种突变的纯合和复合杂合小鼠均出现早期胚胎死亡，而Sars2 Ins12和dupC杂合小鼠的骨骼肌组织出现显著下调、线粒体翻译受损和线粒体形态异常。

在这项研究中，发现了一种导致线粒体HUPRA综合征的新的SARS2点突变，这扩展了与SARS2缺乏相关的临床表型。运用分子、结构、细胞和遗传的方法和技术手段，系统分析了SARS2点突变对SARS2结构和功能、线粒体翻译和功能的综合影响。揭示了hmtRNASer(AGY)的选择性降解导致其稳态水平显著下降是SARS2基因突变导致线粒体疾病的致病机制，这大大加深了人们对mt-aaRS功能障碍相关线粒体疾病分子机制的认识。本研究为此类疾病的临床诊断、疾病干预和治疗策略的制定提供了理论依据。

SARS2突变导致线粒体疾病的发病机制