终结天价时代!CAR

同种异体CAR-NK细胞的一个主要优势是随用随取，这依赖于良好的冻存工艺，随后才有可能从特定的细胞源产生大量的同质批次。许多NK细胞来源已被用于生产同种异体CAR-NK细胞。

NK-92细胞系

NK-92是一种白细胞介素2依赖性、EBV 阳性自然杀伤细胞系，来源于一名患有快速进展性非霍奇金淋巴瘤的 50 岁白人男性的外周血单核细胞，它们具有高度细胞毒性。它们的表型包括激活受体 NKp30、NKp46和NKG2D。有趣的是，NK-92表面上唯一的抑制性受体由 ILT2、CD94-NKG2A（识别HLA-E）和表达水平较低的抑制性KIR受体KIR2DL4代表。它们的使用非常方便，因为理论上可以批量生产和 无限 生成CAR-NK细胞，在细胞数量、时间和成本方面都有巨大的收益。不过由于它们的肿瘤性质，这些源自NK-92细胞系的CAR-NK细胞需要在注射前进行照射，从而改变它们的寿命和分裂。尽管受到照射，它们似乎保留了它们的细胞毒能力，但它们的体内增殖能力发生了急剧变化，注射后7天内消失，需要多次注射。

在三名淋巴清除化疗后复发和难治性AML患者中，已经报道了在人类患者中使用CAR-NK细胞的一些证据，这些患者的 CD33-CAR-NK 细胞来源于 NK-92细胞系[39]。这三名患者接受了挽救性化疗，然后以增加的剂量注入抗 CD33 CAR-NK细胞（每位患者使用三个递增剂量的辐照 CAR-NK-92细胞）。每名患者安全应用多达 5 109个 CD33-CAR-NK 细胞，没有明显的副作用或3-4级毒性；只报告了短暂的发烧。然而，即使治疗耐受性良好并且重复输注的安全性得到证实，所获得的疗效反应也非常短暂，一名患者只有10天，另一名患者最多4个月 [39]。

在体外，慢病毒CD33-CAR载体在NK-92细胞中的效率远高于90%，但细胞毒性试验表明，与亲代NK-92细胞相比，对人 HL-60早幼粒细胞白血病细胞系的细胞毒性适度增强[39]。CAR-NK-92细胞也已针对多发性骨髓瘤细胞进行了探索。江等人报道了用抗 CD38 转导的NK-92细胞在体外以及在异种移植 NOD-SCID 小鼠模型中，对骨髓瘤细胞系和原发性骨髓瘤细胞具有很强的抗肿瘤活性 [40]，用表达抗 CS1/SLAMF7 CAR的NK-92 细胞观察到类似的结果 [41]。

为了提高源自NK-92细胞系的CAR-NK细胞的效率，最初用于T 细胞的第4代CAR在一个名为 UniCAR 的平台上生产。UniCAR 系统由两个元素组成：

（i）针对肽表位 E5B9 的 CAR-NKG2 一种非天然在细胞表面表达的抗原；

(ii) 称为目标模块 (TM) 的双特异性组件。这种双特异性模块在一侧表达 E5B9 抗原，另一侧表达对肿瘤抗原特异的抗体（图 2）。该构建体使 CAR-NKG2 细胞（通过E5B9抗原）和靶细胞（通过特异性抗体）之间能够接触。除此之外，效果可以立即停止（开/关效果），因为 TM 的寿命很短。一旦停止TM的稳定（连续）输注，TM就会被淘汰，UniCAR也会失活。事实上，该系统通过改变可以同时或以顺序方式给予的TMs来实现大量肿瘤抗体的靶向选择 [42]。

图2. UniCAR-NK-92 对 GD2+ 肿瘤细胞的作用

源自脐带血的 NK 细胞

脐带血是NK细胞的丰富而有趣的来源，因为国际血库有数十万个脐带血 (UCB) 单位可供使用。NK细胞占脐带淋巴细胞的15%至 30%。它们的表型比成人外周血细胞的表型更不成熟，具有非常特殊的特征，包括低CD16（低ADCC能力）、CD56 bright（比细胞毒性更具有增殖能力）、NKG2A+（一种抑制性受体，识别 HLA-E）和低 KIR（功能比其对应物少）[43]。然而，这些限制可以通过使用细胞因子和转染的离体扩增和激活来克服，并且根据笔者的经验，与来自血细胞的 CAR-NK 相比，来自脐带血的 CAR-NK 细胞在流式细胞术中观察到具有相同的激活特征。即使 UCB 中的 NK 细胞或多或少稀少，它们也具有非常重要的增殖能力，并且对细胞因子刺激非常敏感，可以进行离体扩增。

由 Tezvani 等人带领的 MD Anderson 团队。最近发表了一项非常令人鼓舞的 I/II 期临床试验，该试验在 11 名患有复发性难治性 B 细胞恶性肿瘤（从非霍奇金淋巴瘤到慢性淋巴细胞白血病）的患者中注射来自新鲜 UCB 的CAR-NK-CD19 细胞（ClinicalTrials.gov ，NCT03056339）（图3）。用研究中使用的三种剂量之一（1 105、1 106或1 107每公斤细胞数）在淋巴清除化疗（氟达拉滨和环磷酰胺）后。

值得注意的是，UCB NK细胞输注后没有注意到不良反应或毒性，特别是CRS 或神经毒性，试验中未达到最大耐受剂量。反应在注射后的第一个月迅速出现，在11名受试者中，有7名患者完全缓解，并在 Richter 转化中恢复到CLL状态。尽管如此，重要的是要展示一个事实，即一半的患者在注射NK细胞后接受了维持治疗，由来那度胺、利妥昔单抗、维奈托克或HSCT组成的综合方案。在注射后长达12个月内检测到NK细胞。最有可能的是，在 CAR结构中添加IL-15基因有助于CAR-NK细胞的长期存活，尽管持久性机制尚未阐明。

此外，一个可能且非常重要的技术挫折是直接从新鲜UCB生产 CAR-NK细胞，以及在生产后立即注射，没有任何冻存步骤。事实上，由于从冷冻保存的细胞中选择NK细胞的效率低，可能不应该推荐使用来自国际银行的冷冻保存的脐带血来生产CAR-NK细胞。根据 MD Anderson 团队的经验，从新鲜脐带血中扩增可能是一种选择 或者更确切地说，建立选定的冷冻保存的NK细胞库，这些细胞可以解冻和扩增以进行转导。还应注意的是，CAR-NK细胞在冷冻保存后活性有所降低，在目前的技术条件下，CAR-NK细胞应在培养后立即给药。即使CAR-NK细胞的具体长期疗效难以评估，并且该工艺在冷冻细胞上的可行性尚待确定，但结果非常有希望[44]。

图3. 来自脐带血的 CAR-NK 细胞：CAR-NK 细胞的结构[45]，来自 MD 安德森中心。CAR-NK 细胞是从具有共刺激 CD28 结构域的经典 CD19 CAR 获得的，其中添加了自杀基因和 IL-15 基因。

来自外周血的NK细胞

如前所述，大多数采用过继性NK疗法（不包括CAR-NK细胞）的研究都使用了来自单倍体相关或不相关供体的细胞，并已在儿童和成人AML中显示出抗肿瘤反应 [29,46]。然而，缺点是需要从健康的成年志愿者那里收集细胞，这使得该过程比使用UCB稍微复杂一些。在细胞因子存在的情况下，一些简单的、符合GMP的培养条件可以将它们的扩增提高25-55倍 [49]。如果来自PB的NK细胞与CB NK细胞相比具有高细胞毒性，那么在CAR-NK疗法的背景下，供体在HLA不相容性方面的选择是否应该有所不同仍有待证明。

Leivas 等人的团队描述了一种可以使用和衍生自PBMC的方法[53]。在活化和扩增的NK细胞 (NKAE) 和记忆T细胞 (CD45RA-T 细胞) 之间选择效应细胞。NK或T细胞在与NKG2D-4-1BB-CD3z-CAR 载体一起培养后转导，使用在NK和T细胞上表达的 NKG2D 激活剂受体，以及用于转导的4-1BB（见上文）。NKG2D 具有特定的配体，包括 MICA、MICB 和 ULBP，它们在应激细胞和许多肿瘤细胞上表达，特别是在多发性骨髓瘤中。在体外，记忆T细胞的转导比其NK对应物更稳定。然而，CAR-NKAE细胞在体外对MM细胞表现出更强的细胞毒性，同时保护健康细胞免受损伤。此外，在他们的小鼠异种移植骨髓瘤模型中，与T细胞相比，CAR-NKAE细胞表现出高效的细胞毒性和增强的抗骨髓瘤活性。

另一种方法是使用 Cas9/RNP 和腺相关病毒基因递送的 CRISPR 靶向 CAR 基因插入。使用这种技术，产生了具有不同跨膜和信号结构域（CD4/4-1BB+CD3 和 NKG2D/2B4+CD3 ）的靶向 CD33 的CAR-NK，并且似乎在原代NK细胞中显示出增强的抗 AML活性 [54]。

源自 iPSC 的 NK 细胞

诱导多能干细胞 (iPSC) 是经过基因重编程成为多能干细胞的分化细胞。成熟分化细胞重编程为 iPSC 的过程包括对细胞进行基因改造，使其表达四种基因：Klf4、C- myc、Oct3/4和Sox2，从而具有与胚胎干细胞相同的特征。因此，分化的成人重编程细胞获得了无限增殖的潜力，并且在加入特定生长因子后可以分化成任何细胞类型，这使得它在许多医学领域都有用武之地 特别是再生医学、细胞疗法或遗传病的模型化。这一发现获得了 2012 年诺贝尔医学奖，授予神户大学（日本）研究员山中伸也 [55]。

由于它们的永生特性，单个iPSC足以生产和生成通用的 CAR-NK 现货 产品。由iPSC产生的NK细胞具有不成熟的表型，具有低CD16、高 NKG2A和低KIR，具有较差的细胞毒性，但具有非常重要的增殖能力。为了增强它们的细胞毒性并使其持久存在，可以添加用于表达CD16 和 IL-15 或 IL-2的基因 [56, 57]。

FT596产品是第一个 即用型 、通用和同种异体CAR-NK细胞产品，源自iPSC技术，并且已经获准在美国用于临床研究 [58]。它由针对NK细胞优化的抗CD19 CAR组成，具有激活剂受体 NKG2D的跨膜结构域、2B4共刺激结构域和 CD3 信号传导结构域。添加了两个关键成分：

(i) 一种新型、高亲和力、不可切割的 CD16 Fc 受体 (hnCD16)，可在没有负调控的情况下实现肿瘤靶向和增强抗体依赖性细胞毒性，并结合靶向治疗性单克隆抗体肿瘤细胞；

(ii) 促进细胞因子非依赖性持久性的 IL-15/IL-15 受体融合蛋白 (IL-15RF)（图 4）。当与利妥昔单抗（抗CD20）等单克隆抗体联合使用时，FT596的hnCD16 Fc受体与覆盖肿瘤细胞的单克隆抗体的Fc部分结合，激活NK细胞，分泌细胞因子，增强ADCC。IL-15RF促进NK细胞和活化的抗肿瘤 T 细胞的细胞毒性。

ASH 2020期间的一份通讯报道了一名76岁女性在接受八线治疗（包括 ASCT、自体过继 T 细胞治疗和活化的半相合NK细胞）后复发难治性 DLBCL 的病例 [59]。

图4. 源自iPSC的 FT596 细胞的作用机制

该患者在淋巴清除单药治疗后接受了独特剂量的30 106 FT596 细胞。除了中性粒细胞减少症外，没有报告与FT596细胞相关的副作用。在1个月阈值的肿瘤反应评估显示基于 2014 Lugano 标准的部分反应，18 F-Glu 吸收减少超过70%，肿瘤大小减少超过 50%。该患者的第二剂 FT596 正在进行中。一项 I 期研究也在进行中，估计有 285 名患者入组（clinicaltrials.gov：NCT04245722）。