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PNAS:梁好均/鲍坚强团队开发新型DNA供体,提高CRISPR基因敲入效率

来源:生物世界 2023-06-06 14:42

近日,中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家研究中心、化学与材料科学学院梁好均教授团队与生命科学与医学部鲍坚强研究员团队合作,在《美国国家科学院院刊》(PNAS)上发表了题为:Efficient pr

CRISPR技术改变了我们操纵基因组进行研究和基因治疗的能力,使用带有同源臂的外源供体作为模板依赖同源介导修复(HDR)途径来精确敲入基因。然而,对于基因大小的DNA供体模板,HDR途径较为低效。目前,可采用在ssDNA或dsDNA供体末端引入化学修饰以增强供体稳定性,供体共价连接到CRISPR系统上提高切割位点局部浓度等方法提高基因敲入效率。然而,这些方法具有操作困难、成本高等问题。

因此,亟需进一步优化基因敲入的供体,以促进CRISPR-Cas9介导的大片段基因敲入在生命科学和临床治疗中的应用。

近日,中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家研究中心、化学与材料科学学院梁好均教授团队与生命科学与医学部鲍坚强研究员团队合作,在《美国国家科学院院刊》(PNAS)上发表了题为:Efficient precise integration of large DNA sequences with 3 -overhang dsDNA donors using CRISPR/Cas9的研究论文。针对目前基因敲入供体的低效率、高成本等问题,优化并提出了一种新型的功能核酸供体,提高了基因敲入的效率。

梁好均课题组深入研究了单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)作为供体的基因敲入机理,结合课题组在核酸化学领域的经验,在单个供体中整合ssDNA和dsDNA的独特优势,设计并提出了一种具有3 悬突的dsDNA结构 odsDNA,并将其作为供体实现CRISPR-Cas9介导的大片段基因敲入(LOCK)。

这也是梁好均课题组继dsDNA供体5 末端化学修饰提高基因敲入效率和RNA介导的CRISPR-dCas9转录调控系统之后,在基因编辑方向的又一重大突破。

该研究提出了一种经济普适的方法来制备任意3 悬突长度的odsDNA供体,利用链中带有连续五个硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰的引物通过PCR扩增目的基因序列,再通过Lambda核酸外切酶处理,得到具有3 悬突的odsDNA。

图1.(A)ssDNA供体基因敲入的机理,(B)dsDNA供体基因敲入的机理,(C)odsDNA的结构,(D)odsDNA供体基因敲入的机理

研究通过比较基因大小(1.1kb和2.5kb)的DNA供体的敲入效率,发现odsDNA显著提高了靶向精确敲入效率,且与通用的dsDNA供体相比最高可提高4.3倍,同时在许多哺乳动物细胞跨多个基因组位点中保持了较低的插入缺失率和脱靶事件。

当利用3 单链悬臂与偶联技术结合时,使用odsDNA供体的敲入效率比dsDNA供体提高5.2倍。该大片段基因敲入(LOCK)策略在基因敲入中具有优势,有望在未来取代ssDNA或dsDNA供体,实现其他策略无法完成的大片段基因敲入。

图2.odsDNA的合成示意图及用于基因敲入的三种方法

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