Mol Cell

这项技术的核心原理是将酶促反应与化学标记相结合，利用优化后的TET酶促反应将RNA m5C氧化至f5C，进一步使用叠氮茚二酮（AI）对于氧化产生的f5C进行特异性标记，标记产物不仅可以产生C-to-T的转变，并且还可以通过点击化学反应进行富集，从而实现对于m5C修饰单碱基分辨率的直接检测（图1A）。这一直接检测的特性使其能够灵敏检测修饰比例低至2.5%的位点（图1B）。此外该方法还具有反应条件温和、不影响转录组碱基组成的特点，因此可以应用于低丰度和低序列复杂度的转录本。同时，结合multiplexing文库构建策略，不仅可以减少样品之间的技术误差，并且能够实现m5C修饰的半定量检测。

图1：m5C-TAC-seq可以实现单碱基分辨率m5C位点检测。A. m5C-TAC-seq原理及流程图；B. m5C-TAC-seq计算的C-to-T转化率与m5C修饰比例呈现正相关；C. m5C-TAC-seq可以实现对于rRNA已知位点与未知位点的灵敏检测；D. 未修饰HeLa转录组文库对照分析提示2,499个m5C位点中只有6个位假阳性位点；E. 四元碱基组成大大提高了比对准确度；F. caRNA上m5C修饰位点分布（Credit:Molecular Cell）

为了评估m5C-TAC-seq的灵敏性和准确性，研究人员首先将其应用于rRNA和tRNA上。在rRNA上，m5C-TAC-seq不仅能够精准检测已知的高m5C修饰位点，并且还鉴定了一个新的低修饰位点m5C3683及其修饰酶（图1C），验证了m5C-TAC-seq的灵敏度。此外，对于具有复杂二级结构且序列复杂度较低的tRNA，m5C-TAC-seq不仅能够鉴定所有已报道位点及其修饰酶，并且由于保留了四元碱基组成使得其可以实现对不同tRNA isodecoder的精准检测。利用m5C-TAC-seq，研究人员绘制了HeLa、HEK293T和mESC的单碱基分辨率m5C修饰图谱，分别鉴定了2499、765和664个m5C位点，并利用无修饰转录组文库进行对照分析验证了这些位点的可靠性（图1D）。更为重要的是，鉴定了绝大多数m5C位点的甲基转移酶，进一步确认了这些位点的准确性。此外，与BS-seq相比，m5C-TAC-seq在低修饰位点的检测上也表现出高精度和高灵敏度，提示其直接检测策略的鲁棒性。

进一步研究发现，除了已知的NSUN2和NSUN6，rRNA甲基转移酶NSUN5也可以作用于mRNA，这一发现与近期中山大学张锐团队开发的高灵敏motif分析工具iMVP在mRNA上鉴定到的NSUN5 motif一致【10】。此外，利用m5C-TAC-seq，研究人员还发现在mESC的分化过程中，大部分mRNA上m5C位点呈现甲基化水平下调趋势，并且富集在细胞周期及细胞分裂相关通路的转录本上，提示了m5C修饰可能参与到mESC分化过程中。得益于温和的反应条件及对碱基组成的保留（图1E），m5C-TAC-seq实现了对含有大量低复杂度序列的chromatin-associated RNA（caRNA）上m5C位点的鉴定（图1F），提示了四元碱基的保留对于低复杂度序列上m5C修饰检测的重要性。

综上所述，该研究开发了直接检测m5C修饰的新技术m5C-TAC-seq，并展示了m5C-TAC-seq技术高灵敏、高精准的检测特性。m5C-TAC-seq不仅可以应用于包括低丰度、低序列复杂度在内的多种类型RNA和低修饰比例m5C位点的检测，并且可以实现在多种生物学过程中m5C修饰的动态检测，将有助于理解和推动RNA m5C修饰生物学功能的探究。