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Nature子刊:陈斯迪团队开发多种Cas12a 敲入小鼠模型,用于多重基因组编辑、疾病建模和免疫细胞工程

Nature子刊:陈斯迪团队开发多种Cas12a 敲入小鼠模型,用于多重基因组编辑、疾病建模和免疫细胞工程

来源:生物世界 2025-03-25 09:51

在这项最新研究中,陈斯迪教授团队开发了一系列背景为 C57BL/6 的 Cre 依赖的条件性表达小鼠或组成性表达 Cas12a 小鼠模型,包括 LbCas12a 和高保真增强版 AsCas12a。

耶鲁大学陈斯迪课题组在Nature Biomedical Engineering期刊发表了题为:Cas12a knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune cell engineering的研究论文。

该研究开发出多种 Cas12a 敲入小鼠模型,助力针对复杂基因互作网络,疾病建模与遗传学的研究。

在这项最新研究中,陈斯迪教授团队开发了一系列背景为 C57BL/6 的 Cre 依赖的条件性表达小鼠或组成性表达 Cas12a 小鼠模型,包括 LbCas12a 和高保真增强版 AsCas12a(enAsCas12a-HF1)。

研究团队首先通过与 CMV-Cre 小鼠交配获得了组成性表达 Cas12a 蛋白的小鼠,验证了 Cas12a 蛋白的表达及在不同主要器官中的表达量,并通过全鼠表型分析证实 Cas12a 的组成性表达并未导致与 C57BL/6 背景品系相比的任何可辨别的病理差异。通过使用 LbCas12a 和 enAsCas12a 小鼠原代免疫细胞,他们在 T 细胞和骨髓来源的树突状细胞(BMDC)中实现了高效的双基因编辑(Double Knockout)。高通量测序结果显示,使用 enAsCas12a 小鼠系统可以在这些细胞类型中实现高达 90% 的基因编辑效率。

为了验证 Cas12a 敲入小鼠在体内基因编辑中的应用,研究团队使用 LNP 系统将靶向 Ttr 基因的CRISPR RNA(crRNA)递送到组成性表达 enAsCas12a 的小鼠体内。实验结果显示,注射后 6 天,血清中 TTR 蛋白水平显著下降,并在 20 天内保持稳定。这表明,LNP-crRNA 系统在体内具有高效的基因靶向能力。

为了进一步验证 Cas12a 敲入小鼠优越的的体内基因编辑效率及在癌症建模中的应用,研究团队设计了一个包含四个肿瘤抑制基因(Trp53、Pten、Apc和Rb1)的 AAV-crTSG 表达阵列,并通过 AAV 系统递送到条件性表达 enAsCas12a 小鼠体内。结果显示,注射后一个月内,所有注射 AAV-crTSG 的小鼠均在头颈部位形成了侵袭性肿瘤,而对照组小鼠(注射AAV-vector)未观察到肿瘤形成。组织学分析显示,这些肿瘤具有典型的鳞状特征,并且中表达 enAsCas12a-HF1-GFP 蛋白,表明肿瘤的形成是由 AAV-crTSG 介导的基因编辑引起的。

为了实现同步基因激活和敲除,研究团队将 LSL-enAsCas12a-HF1 小鼠与 dCas9-SPH 转基因小鼠交配,生成了 LSL-enAsCas12a-HF1;dCas9-SPH 双转基因小鼠。双转基因老鼠及配合设计的一个包含 Cas9-sgRNA 和 Cas12a-crRNA 的融合引导 RNA 系统,研究团队建立了一个同时进行双基因激活和敲除(DAKO)的系统。DAKO 系统的有效性在 BMDC 细胞实验中得到验证,流式分析实验结果显示,DAKO 系统在单个细胞水平上同时实现双基因激活和敲除,为研究复杂基因相互作用网络提供了强大的工具。

Cas12a 敲入小鼠的开发为多重基因编辑、疾病建模和免疫遗传学研究提供了一个强大的平台。这些小鼠品系及其伴随的病毒和非病毒递送载体,共同构成了一个广泛适用的工具包,能够应用于基因编辑、免疫细胞工程、免疫学发现和复杂基因相互作用的解卷积。随着递送载体的优化及靶点组合的精确设计,Cas12a 敲入小鼠有望在临床治疗中发挥重要作用,不仅应用于,还可扩展至其他疾病领域,为个性化治疗和通用治疗铺平道路。

该研究由耶鲁大学陈斯迪教授课题组主导完成,耶鲁大学博士学生唐开元和周立群为该论文的共同第一作者。陈斯迪教授、约翰 霍普金斯医学院Matthew Dong,以及即将成为威斯塔研究所(The Wistar Institute)独立PI的周小宇博士为该论文的共同通讯作者。

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