Nature：Cas9的“B面人生”——从基因剪刀到免疫记忆的调速器

当 明星 卸下光环：无RNA的Cas9竟是 超级适应 的幕后推手

要理解这项发现的颠覆性，我们先回到CRISPR-Cas系统的核心功能 适应性免疫。这个过程的第一步，被称为 适应 （adaptation）或 间隔序列获取 （spacer acquisition），是整个免疫系统的基石。当一个病毒首次入侵细菌时，Cas1和Cas2这两个蛋白会像情报官一样，从病毒的DNA上切下一小段 罪证 ，即 前间隔序列 （protospacer），并将其作为新的 间隔序列 （spacer）插入到细菌基因组的CRISPR阵列中。这个CRISPR阵列，就像一个不断更新的 黑名单 ，记录了细菌曾经遭遇过的所有敌人。随后，这个阵列会被转录并加工成许多小的CRISPR RNA（crRNA），每一个crRNA都包含一个间隔序列，作为识别病毒的 通缉令 。

研究人员以一种常见的细菌，脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）作为模型。它的CRISPR系统属于II-C型，相对简洁，是研究Cas9功能的理想体系。在正常的实验条件下，研究人员发现，当用一种名为MDAO的噬菌体感染这些细菌时，新的间隔序列获取事件非常罕见，其效率仅有大约1%。这符合我们的一贯认知：免疫记忆的形成是一个低概率事件，确保了系统的稳定，避免了不必要的免疫反应。

然而，当研究人员进行了一项看似常规的基因敲除实验后，惊人的现象发生了。在CRISPR-Cas9系统中，crRNA需要与另一个辅助性的小RNA，即tracrRNA，共同组装到Cas9蛋白上，才能形成有功能的切割复合物。研究人员首先尝试敲除了编码tracrRNA的基因。按照常理，失去tracrRNA会导致Cas9无法正确加载crRNA，从而使整个免疫系统的 攻击 功能失灵。但令人意想不到的是，这群 手无寸铁 的细菌，在间隔序列获取能力上却表现出了惊人的爆发。在诱导Cas1-Cas2蛋白过表达以增强检测信号的条件下，野生型细菌的间隔序列获取效率约为6%，而在敲除了tracrRNA的突变株中，这一效率飙升到了61%，足足提升了10倍！

这一现象同样发生在直接破坏crRNA生产的菌株中。研究人员构建了一个名为R26的突变株，它几乎无法产生任何成熟的crRNA。结果显示，在相同的诱导条件下，其间隔序列获取效率从野生型的5%跃升至44%。这种效率的急剧提升，被研究人员形象地称为 超级适应 （super-adaptation）。

这背后隐藏着什么机制？一个直接的猜想是，由于免疫系统的 攻击 功能失效，那些错误地获取了自身基因组片段作为间隔序列的细菌得以存活，从而在群体中被富集，造成了获取效率虚高的假象。为了验证这一点，研究人员进行了一个巧妙的对照实验。他们将Cas9蛋白的关键切割位点进行突变，得到了一个只能结合DNA但无法切割的 死 Cas9（dead Cas9, dCas9）。如果上述猜想成立，那么dCas9菌株本身就因为没有攻击能力，不应该再对tracrRNA或crRNA的缺失产生反应。然而，实验结果却否定了这一猜想。在dCas9背景下，敲除tracrRNA或crRNA同样引发了 超级适应 现象。

这一系列证据将矛头指向了一个共同的结论： 超级适应 的出现，并非源于免疫攻击功能的丧失，而是有一个积极的因素在背后推动。这个因素，正是那个卸下了RNA 光环 的Cas9蛋白本身，apoCas9。当细胞中缺少tracrRNA或crRNA时，大量的Cas9蛋白无法与RNA结合，以apoCas9的形式存在。正是这些 自由 的apoCas9，扮演了幕后推手的角色，极大地促进了新的间隔序列整合到CRISPR阵列中。Cas9蛋白的 B面人生 ，第一次清晰地展现在我们面前。

动态平衡的艺术：Cas9如何感知 免疫库存 并调控 补货 速度

如果apoCas9是免疫记忆获取的 油门 ，那么RNA加载的Cas9则扮演了 刹车 的角色。这一发现揭示了一个精巧的动态调控机制。但是，细菌在什么生理情境下需要踩油门，又在什么时候需要踩刹车呢？研究人员提出了一个大胆而合乎逻辑的假设：细菌或许可以通过调节细胞内apoCas9与RNA负载型Cas9的比例，来感知自身的 免疫库存 状态，并相应地调整免疫记忆的 补货 速度。

我们可以用一个生动的比喻来理解这个过程。想象一下，一个国家的免疫系统就像是它的国防情报数据库。当这个国家刚刚建立（对应于一个新生的CRISPR阵列，即CRISPR neogenesis），或者情报库因故遭到大规模损毁时（对应于CRISPR阵列的删减或收缩），它最紧迫的任务就是快速、大量地收集关于潜在敌人的情报，以充实数据库。这时，情报收集的效率必须最大化。反之，当数据库已经非常完备，包含了大量敌人的信息时，情报收集工作就可以放缓，变得更加审慎，以避免将友方信息错误地录入数据库，引发 内乱 （即自身免疫反应）。

在这个比喻中，CRISPR阵列的长度就代表了 免疫库存 的丰富程度。一个长的CRISPR阵列可以产生大量的crRNA，而一个短的阵列产生的crRNA则非常有限。研究人员推测，细胞内的crRNA丰度，正是Cas9感知 免疫库存 的关键信号。为了验证这一假设，他们着手模拟 CRISPR新生 的过程。他们构建了一系列脑膜炎奈瑟菌菌株，这些菌株的CRISPR阵列长度各不相同，从野生型拥有的25个间隔序列，逐步缩短到7个、5个、3个、1个，乃至只有一个重复序列（相当于一个空的 黑名单 ）。接下来，他们检测了这些菌株在面对噬菌体感染时的间隔序列获取效率。

实验结果完美地印证了他们的假设。数据的相关性清晰得令人赞叹：CRISPR阵列的长度与间隔序列的获取效率呈现出强烈的负相关关系。拥有完整长阵列的菌株，其获取效率最低，约为4-6%。当阵列缩短到5-7个间隔序列时，效率提升至8-10%。而对于仅有1-3个间隔序列的 免疫新生 菌株，其效率高达20-30%。最极端的情况下，那个只有一个重复序列、几乎没有任何免疫记忆的菌株，其获取效率达到了惊人的31%！

与此同时，研究人员通过Northern blot技术检测了这些菌株内crRNA的水平，发现其变化趋势与获取效率的变化趋势正好相反。阵列越长，crRNA水平越高；阵列越短，crRNA水平越低。这幅景象清晰地描绘了一个自动调节的反馈回路：

1.当免疫库存不足时（短CRISPR阵列），细胞内的crRNA水平很低。大量的Cas9蛋白处于 自由 的apoCas9状态。这些apoCas9作为 加速器 ，全力推动新的间隔序列获取，帮助细菌快速建立起初始的免疫记忆库。

2.随着免疫库存的充实（CRISPR阵列变长），crRNA的产量不断增加。越来越多的Cas9蛋白与crRNA-tracrRNA结合，转变为RNA负载的 哨兵 状态。ApoCas9的数量相应减少， 油门 被松开，间隔序列的获取速度自然就慢了下来。

这个系统堪称动态平衡的艺术。它确保了细菌在 免疫幼稚 或 免疫受损 时能够迅速反应、补充防线，又能在 免疫成熟 时保持稳健，将资源更多地用于 防御 而非 学习 ，同时也降低了因过度学习而引发自身免疫的风险。

丢盔弃甲 后的绝地求生：当免疫记忆库遭遇重创

模拟实验的结果令人信服，但这种调控机制在真实的、由生存压力驱动的场景下是否同样适用呢？为了回答这个问题，研究人员设计了一个更为贴近自然的进化博弈实验。在细菌的世界里，免疫系统并非总是好事。有时，CRISPR阵列中的某个间隔序列可能会靶向一个对细菌有益的DNA序列，例如，一个携带了抗性基因的质粒。这时，细菌就陷入了一个两难的困境：是保留免疫记忆，放弃宝贵的生存优势（抗性）；还是为了获得生存优势，而 自废武功 ，放弃一部分免疫记忆？

研究人员人为地创造了这样一个情景。他们将一个含有特定靶点序列（对应于细菌CRISPR阵列中的第6个间隔序列）和氯霉素抗性基因的DNA片段，导入到野生型脑膜炎奈瑟菌中。正常情况下，由于间隔序列6的存在，任何试图整合这段外源DNA的细菌都会触发自身免疫反应而被杀死。然而，在巨大的生存选择压力下（即在含有氯霉素的培养基上生长），总会有少数 逃逸者 （escapers）能够存活下来。

这些 逃逸者 是如何做到的？通过对它们的基因组进行测序，研究人员发现，最常见的逃逸策略之一就是 CRISPR阵列塌陷 （array collapse）。这些细菌通过基因重组，精确地删除了包含间隔序列6在内的一整段CRISPR阵列。它们相当于为了生存而 丢盔弃甲 ，牺牲了一部分的免疫记忆。这些 丢盔弃甲 的幸存者，为研究人员提供了一个绝佳的天然模型。它们的CRISPR阵列自然地变短了，免疫库存也因此受到了重创。根据之前的理论，这些细菌现在应该会启动 加速补货 模式。

事实正是如此。研究人员在不人为过表达任何蛋白的条件下，检测了这些天然 逃逸者 的间隔序列获取能力。结果发现，与拥有完整阵列的野生型祖先相比，这些CRISPR阵列收缩的 逃逸者 ，其新生间隔序列的获取效率显著提高，最高可提升5倍之多。在另一些模拟短阵列的菌株中，这一提升幅度甚至达到了2.5至7.7倍。

这个实验有力地证明了，apoCas9的调控功能并非实验室里的人为现象，而是一种深刻嵌入在细菌生理与进化过程中的真实响应。当免疫系统为了适应环境而被迫做出牺牲时，apoCas9介导的 超级适应 机制会立刻启动，帮助细菌在渡过难关后，迅速重建其受损的防御体系，为下一次未知的威胁做好准备。这是一种深刻的 生存智慧 ，让细菌在灵活性与稳定性之间找到了完美的平衡点。

解构Cas9：哪个 部门 负责加速，哪个 部门 负责刹车？

我们已经知道了apoCas9在做什么，以及为什么这么做。但从分子层面来看，它是如何实现的呢？Cas9是一个巨大的多结构域蛋白，就像一个复杂的多部门公司。究竟是哪个 部门 负责踩油门，哪个 部门 又负责踩刹车？Cas9蛋白主要可以分为两个大的功能 叶 （lobe）：一个是负责识别和结合RNA及DNA的REC叶（recognition lobe），另一个是负责切割DNA的NUC叶（nuclease lobe）。NUC叶本身又包含HNH和RuvC等多个切割结构域。

为了厘清各个 部门 的职责，研究人员对Cas9蛋白进行了系统性的 解剖 ，通过基因编辑，逐一删除其不同的结构域，然后观察这些 残缺 的Cas9蛋白是否还能介导 超级适应 。实验是在同时缺失crRNA和tracrRNA的背景下进行的，以确保所有Cas9都处于apo状态。结果清晰地划分了责任：

NUC叶是 油门 ：当研究人员删除了NUC叶中的HNH、RuvCII或RuvCIII等关键结构域时， 超级适应 现象几乎完全消失，获取效率从45%骤降至3-4%，与完全敲除Cas9的效果类似。这表明，apoCas9的促适应活性，正蕴含在其NUC叶中。

REC叶是 刹车 ：最令人震惊的结果来自于REC叶的删除。当研究人员构建了一个缺少整个REC叶（即 REC1/2）的突变Cas9蛋白时，这个蛋白展现出了前所未有的 疯狂 。它不仅在没有RNA的情况下能引发 超级适应 ，更重要的是，即使在细胞内存在足量的crRNA和tracrRNA时，它依然我行我素，持续地高速促进间隔序列获取！

这个结果的含义极为深刻。它说明REC叶的功能，就是作为RNA的 停靠港 和信号传导器。当crRNA和tracrRNA这对 刹车信号 到达时，它们会结合在REC叶上。REC叶接收到信号后，会通过构象变化，抑制NUC叶固有的 加速 活性。而一旦REC叶被整个移除，就等于切断了 刹车线 。无论外界有多少 刹车信号 （RNA），NUC叶这个强大的 引擎 都无法接收到，只能永远保持在 油门踩到底 的状态。通过这一系列巧妙的结构域分析实验，研究人员不仅定位了Cas9蛋白内部的功能模块，更揭示了其调控活性的分子基础：apoCas9的NUC叶天生就具有促进间隔序列获取的活性，而REC叶则通过结合向导RNA，来抑制这种活性，从而实现对整个适应过程的精细调控。

家族的共同智慧？ApoCas9的调控角色或非个例

脑膜炎奈瑟菌的II-C型CRISPR-Cas系统为我们揭示了这个令人赞叹的调控机制。但这会不会只是一个特例，是这个物种在漫长进化中偶然演化出的一个 小把戏 呢？为了探究这一机制的普适性，研究人员将目光投向了更广阔的细菌世界。他们挑选了来自不同细菌物种的另外七个II-C型Cas9蛋白的同源物，包括来自流感嗜血杆菌（Haemophilus parainfluenzae）、产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus succinogenes）和多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）等。这些Cas9蛋白与脑膜炎奈瑟菌Cas9的氨基酸序列相似度从31%到96%不等，代表了II-C家族内部的多样性。

研究人员将这些外源的Cas9基因，以及它们各自对应的sgRNA（一种将crRNA和tracrRNA融合在一起的人工向导RNA），引入到一个已经清除了自身Cas9和相关RNA的脑膜炎奈瑟菌 宿主 中，然后测试它们的适应调控能力。实验结果为这一机制的保守性提供了强有力的支持。在被测试的七个外源Cas9蛋白中，有六个表现出了与脑膜炎奈瑟菌Cas9完全一致的行为模式：

1.在没有sgRNA的情况下，这些Cas9蛋白同样能够引发强烈的 超级适应 ，其间隔序列获取效率高达20-47%。这证明，作为 加速器 的apoCas9功能，在II-C型Cas9家族中是广泛存在的。

2.当它们各自对应的sgRNA被引入细胞后， 超级适应 现象被有效地抑制，获取效率齐刷刷地回落到4-6%的基线水平。这说明，RNA介导的 刹车 机制同样是保守的。

这一发现意义重大。它表明，apoCas9作为免疫记忆获取的动态调控器，并非脑膜炎奈瑟菌的专利，而是II-C型CRISPR-Cas系统一个古老且重要的共同特征。这种功能上的保守性，暗示着它在细菌的生存与进化中扮演着不可或缺的角色，受到了强烈的自然选择压力。细菌们似乎共同演化出了这套 智能调速 系统，以应对环境中复杂多变的病毒威胁。

超越 剪刀 的认知

当我们再次审视Cas9蛋白时，那张 基因剪刀 的标签虽然依旧闪亮，却已不再能完全概括它的全部。这项研究为我们揭示了Cas9蛋白深藏不露的 B面 ，它是一位敏锐的感知者和智慧的调控者。它通过自身是否加载RNA这一简单的物理状态，巧妙地将细胞内的crRNA丰度，这个直接反映免疫记忆库大小的指标，转化为了对新记忆获取速率的精确调控。

这个自我调节的反馈环路，完美体现了生物系统在面对复杂环境时所展现的深刻智慧。它既保证了免疫系统在 空窗期 的快速响应能力，又在系统成熟后回归稳健，防止了能量的浪费和自身免疫的风险。它让我们看到，在微观的分子世界里，同样蕴含着宏观生态系统中常见的稳态与平衡法则。

这一发现也为我们打开了新的思考维度。在那些我们自认为已经非常熟悉的明星分子身上，是否还隐藏着更多未知的 B面 功能？对这些天然调控机制的深入理解，又将如何启发我们更安全、更高效地应用CRISPR这一强大的工具？例如，我们是否可以借鉴apoCas9的 超级适应 能力，开发出更高效的 分子记录仪 ，用于追踪细胞谱系或记录生命活动信息？

从一个简单的基因剪刀，到一个复杂的动态调控枢纽，我们对Cas9的认知之旅，恰如科学探索本身的缩影。即使是在被研究得最透彻的领域，也总有令人惊叹的新大陆等待着被发现。生命在分子尺度上演绎的巧妙与复杂，永远值得我们保持谦逊与好奇，并不断深入地探索下去。

版权声明 本网站所有注明“来源：100医药网”或“来源：bioon”的文字、图片和音视频资料，版权均属于100医药网网站所有。非经授权，任何媒体、网站或个人不得转载，否则将追究法律责任。取得书面授权转载时，须注明“来源：100医药网”。其它来源的文章系转载文章，本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的，转载内容不代表本站立场。不希望被转载的媒体或个人可与我们联系，我们将立即进行删除处理。

87%用户都在用100医药网APP 随时阅读、评论、分享交流 请扫描二维码下载->

医药网新闻