Cell Discovery |
核质转运Cas13d的开发:研究中开发的核质转运Cas13d(nucleocytoplasmic shuttling Cas13d, Cas13d-NCS)能有效将CRISPR RNA(crRNA)从核内转移到细胞质,实现了在细胞质内靶向降解RNA。
提升对细胞质RNA病毒的抗病毒效能:该系统针对如委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equine encephalitis, VEE)病毒和多种严重急性呼吸综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)的菌株显示出显著的抗病毒活性,能完全阻断这些病毒的复制。
潜在的临床应用前景:Cas13d-NCS展示了其在精确调控亚细胞层面RNA靶向和开发新型分子工具及治疗RNA相关疾病的巨大潜力。
Cas13d-NCS(核-胞质穿梭型Cas13d)为高效靶向细胞质RNA和抗病毒设计的工程过程。
a. Cas13d蛋白及其crRNA在哺乳动物细胞中的表达和定位的示意图。Cas13d-NES在C端具有一个NES,对应于v5变体。
b. 使用RNA FISH染色技术,对表达核定位Cas13d-NLS(含3个NLS,即核定位序列,对应于f中的v1)的细胞中的crRNA及GAPDH mRNA进行染色的结果。
c. Cas13d-NCS的示意图,显示其如何将crRNA从核部运输到细胞质。
d. 与核型(v1)或穿梭型Cas13d(v3)共表达的由RNA聚合酶III表达的crRNAs的RNA FISH染色。
e. 对共表达的核型和穿梭型Cas13d的细胞中细胞质/总crRNA染色强度的定量分析。
f. 不同NLS/NES组合的Cas13d穿梭构建的示意图。
g. 不同变体v1-v5的Cas13d蛋白在细胞质/总蛋白染色强度的定量分析。
h. 比较了Cas13d变体v1-v5在纳米荧光素酶表达抑制方面的效果。
i. VEE病毒报告子复制体的示意图。
j. 短期和长期培养后表达复制体的细胞的荧光成像。
k. 使用流式细胞术比较核型和穿梭型Cas13d-NCS在靶向复制体效率上的结果。
l. 针对单一3 UTR crRNA靶向的SARS-CoV-2-GFP报告病毒和病毒转录组的示意图。
m. 在不同靶向条件下通过整合GFP强度实时测量SARS-CoV-2-GFP病毒载量。
n. 在用Cas13d-NCS和靶向或非靶向3 UTR crRNA处理48小时后,通过RNA测序分析SARS-CoV-2(Delta)亚基因组mRNA表达。(Credit:Cell Discovery)
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