《自然》子刊:用高通量液滴微流控技术对接受ART药物治疗的HIV感染者体内的HIV前病毒及其宿主整合位点进行测序

来源：100医疗网原创2022-04-18 09:16

人类免疫缺陷病毒(HIV)的感染是通过将其基因组整合到被感染的宿主细胞中，并进入可逆的潜伏状态，从而逃避抗逆转录病毒治疗(ART)。

人类免疫缺陷病毒(HIV)的目的是将其基因组整合到被感染的宿主细胞中，进入可逆潜伏状态，从而逃避抗逆转录病毒治疗(ART)。对HIV前病毒(即病毒基因组整合到宿主细胞DNA中的HIV)和单个细胞中相邻宿主DNA连接进行测序的能力可以突出其在感染细胞中的作用机制和持久性。但由于背景人类DNA量高出1.5亿倍，这个实验很难进行。

在一项新的研究中，来自加州大学旧金山分校、华盛顿大学、美国国家卫生研究院和陈-扎克伯格生物中心的研究人员展示了全长艾滋病毒原病毒如何通过高通量微流控分析(在自然环境中基于液滴的艾滋病毒DNA全基因组扩增)与艾滋病毒-宿主DNA连接。他们进行PCR反应以标记含有HIV前病毒的液滴，并对来自当时正在接受抑制性ART治疗的HIV感染者的感染细胞进行测序和检测，以检测和测序成对的HIV前病毒基因组和整合位点。本研究试图改进HIV病毒慢性感染细胞库(以下简称HIV病毒库)的基因分析。相关研究成果于2022年3月28日在线发表在《自然生物医学工程》杂志上，题目是“HIV pro病毒的液滴-微流控辅助测序及其在接受抗逆转录病毒治疗的人的细胞中的整合位点”。

艾滋病治疗现状及发展治疗策略

虽然全世界约有3700万人感染了艾滋病毒，但治愈方法仍然未知。这种病毒的感染机制构成了核心障碍，也是治愈疾病的关键，因为艾滋病病毒将其基因组整合到被感染细胞的基因组中。虽然ART可以将病毒复制抑制到检测不到的程度，预防获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的发生，但无法抵抗HIV病毒库。因此，ART必须无限期持续，以防止病毒反弹和疾病进展。终身服用ART药物价格昂贵，很难解决与艾滋病毒相关的污名，而且有潜在的毒性。因此，根除或抑制HIV病毒库以获得功能性治愈是非常重要的。

为了研究HIV病毒库的持久性，科学家必须将整合位点和全长HIV前病毒序列配对。通过建立一种可靠且经济有效的方法来分离和测序罕见的HIV前病毒，这些作者可以全面描述HIV病毒库的特征。他们通过使用同步整合位点和前病毒测序(SIP-SEQ)，开发了一种在HIV病毒数据库中描述HIV前病毒及其细胞基因组背景的方法。

克服困难：获得HIV病毒单一基因组的方法

通过使用全基因组测序扩增，这些作者在自然环境中的微流控液滴中扩增了HIV基因组，然后标记含有HIV前病毒的液滴进行测序。由此产生的方法提供了全长HIV病毒基因组，该基因组通过单一的连续装配与其宿主细胞DNA装配在一起。这种方法的速度和效率允许在高1 . 5亿倍的DNA背景中获得单个HIV前病毒基因组。他们使用SIP-Seq分析了几个ART相关个体的HIV前病毒群，以了解潜在的HIV病毒数据库。虽然他们关注的是HIV，但这种方法适用于各种侵入宿主基因组的病毒，为描述多重感染的遗传特征提供了一个通用平台。

SIP-seq在ART药物感染者治疗中的应用。图片来自《自然生物医学工程》，2022，doi :10.1038/s 41551-022-00864-8。

实验

这些作者旨在从数百万个CD4 T细胞中获得包含HIV基因组的所有DNA片段，对它们进行单独测序，并对它们邻近的宿主DNA连接进行测序。他们从封装在液滴中的宿主细胞中提取大的DNA片段，以分离整合到宿主细胞DNA中的艾滋病毒基因组。使用多重置换扩增(MDA)，他们非特异性扩增每个基因组片段，以获得足够的HIV前病毒进行测序。然后他们分离出带有HIV原病毒的液滴，并用条形码对每个液滴进行编码和测序。然后，他们将每个液滴的阅读片段映射到艾滋病毒参考基因组上，以确定整合位点，从而获得关于艾滋病毒基因组及其整合位点复杂性的清晰信息——这对评估艾滋病毒数据库至关重要。

SIP-Seq和调控微流控技术检测HIV前病毒

为了提高全长HIV前病毒的特异性和防止随机DNA切割，这些作者使用双特异性多重Taqman PCR来靶向HIV基因组的区域。在实验过程中，他们产生了特定量的DNA来测序并确认获得了艾滋病病毒前体。SIP-Seq装置的微流体技术包括三个装置，包括液滴包装器、组合器和分类器。他们将人类基因组DNA片段装载到多重置换扩增(MDA)试剂中，在15分钟内将多达100亿个DNA片段(长度约为75kbp)封装在2000万个独立的液滴中。每个液滴包含500个不同的片段。在与Taqman PCR试剂结合之前，他们将它们放在试管中，并在30下孵育，进行非特异性扩增。在对所有检测到的艾滋病毒基因组重复这些步骤后，他们准备对这些试管进行测序。

接受抗逆转录病毒治疗的感染者HIV前病毒及其基因组图谱分析

这些作者随后在HIV感染的细胞系上验证了SIP-Seq，并分析了接受ART治疗的感染者体内的HIV。在实验中，他们首先在平板上培养接受ART治疗的感染者的静息CD4 T细胞，然后在刺激和体外培养后通过三种方法进行增殖。鸟枪法、巢式PCR和使用Taqman探针的SIP-Seq。SIP-Seq和nested PCR都产生了很好的结果，他们特别选择SIP-Seq来描述体内感染细胞的所有遗传多样性。之后，他们对直接从感染者的CD4 T细胞中分离出的HIV前病毒的基因组特征进行了表征。这些结果表明，与以前对同一个体的研究相比，有三个克隆谱系支持克隆的起源。

前景

这项新研究表明，与现有的PCR方法相比，这些作者开发的方法使他们能够更有效地研究艾滋病毒原病毒。通过表征潜伏HIV病毒数据库的特征，他们全面分析了HIV在体内的基因图谱，突出了HIV病毒数据库在HIV持久性中的作用。现有的方法具有挑战性，因为缺乏明确的表面标记来识别患有潜伏性HIV感染的细胞。使用所描述的SIP-Seq方法，他们提供了一种快速、经济和可扩展的方法。他们将其应用于接受ART治疗的感染者，以突出潜伏的HIV病毒库中存在的克隆扩增细胞。这一战略适用于所有艾滋病毒感染，以及在其生命周期中整合的其他病毒性疾病。(100yiyao.com)

参考资料：

1.孙辰等人。自然生物医学工程，2022，doi :10.1038/s 41551-022-00864-8。

2.使用微滴微流控芯片对接受抗逆转录病毒治疗的人群中的HIV前病毒进行测序

https://medical xpress.com/news/2022-04-测序-HIV-前病毒-人-抗逆转录病毒. html

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