Nature Biotechnology

Nature Biotechnology的报道 Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy 介绍了一种新的共聚焦扫描光场显微镜技术(confocal scanning light-field microscopy,csLFM)，该技术结合了轴向延长的线性共聚焦照明与滚动快门扫描光场显微镜(rolling shutter scanning light-field microscopy, sLFM)，实现了高保真度、高速、三维成像，同时保持了接近衍射极限的分辨率和低光毒性。

csLFM通过同步三维激发和检测，可以将激发强度降低到1 mW mm-2以下，信号与背景比(signal-to-background ratio, SBR)提高了15倍。该技术能够在光学挑战性环境中实现25000个时间帧的亚细胞动态成像，例如在小鼠脾脏中的迁移体(migrasome)传递、小鼠肝脏中的收缩体(retractosome)生成以及果蝇中的三维电压成像。

传统的共聚焦显微镜通过针孔、狭缝或针孔阵列抑制离焦荧光，从而仅捕获焦内光子，获得高SBR。然而，这些方法不可避免地降低了系统的并行度，增加了光毒性。与此相对，光场显微镜(light-field microscopy, LFM)通过在扩展景深(depth of field, DOF)内激发和成像整个体积，最大限度地提高了并行度，同时保持低光毒性。

csLFM通过引入线性共聚焦照明，解决了sLFM在强背景荧光存在下的分辨率下降问题。实验表明，csLFM在成像性能上显著优于传统的共聚焦显微镜和光场显微镜，特别是在背景抑制和成像深度方面有显著改善。在小鼠脾脏的细胞成像实验中，csLFM不仅能够分辨亚细胞结构，还显著提高了SBR，有助于研究免疫细胞间的动态协作行为。

csLFM在观察小鼠肝脏中的收缩体生成时，同样展示了其优越性能。通过降低激发光强度并提高成像对比度，csLFM能够清晰地可视化结构和亚细胞动态。此外，在果蝇的大规模神经记录中，csLFM通过减少串扰，提高了神经活动记录的精度和数据吞吐量，展示了其在高保真度神经记录中的巨大潜力。

csLFM提供了一种高效、低光毒性的三维亚细胞成像技术，能够在复杂的生物环境中实现长时间的高保真度成像，具有广泛的应用前景。