研讨开辟新型微滴反响挑选技巧并展开单细胞剖析使用

中国迷信院微生物研讨所微生物质源后期开辟国度重点试验室杜文斌研讨组和黄力研讨组配合开辟了一种新型的微流控界面纳升打针技巧（Interfacial Nanoinjection， INJ），该技巧可以将传统的生化反响系统微缩在一个纳升体积的油包水微液滴系统中完成。针对这一技巧立异，团队请求了多项中国创造专利和美国专利，并研制了基于INJ技巧的小型桌面零碎。该零碎和国外同类产物如美国Labcyte公司的Echo超声纳升移液零碎以及美国TTP Labtech公司的mosquito HTS微量挑选零碎比拟，在仪器本钱、耗材本钱、最小液滴体积、流式细胞仪兼容性、操作的灵敏性以及净化掌握等方面，均具有明显优势，实用于各类单细胞微体积反响剖析，也可使用于其他微体积反响剖析，在微生物培育挑选、分解生物学、药物挑选、卵白结晶前提挑选等方面均具有使用潜力。

在功能方面，INJ零碎经过高精细度的微体积掌握完成分歧试剂组分的纳升体积分步添加，兼容96和384孔板，可以在事后填装矿物油的孔板上，依照法式设定参加纳升样品或试剂液滴，用于完成高通量挑选。应用低本钱探针可以准确加注的最小体积到达1 nL，当加样体积为5 nL时，体积尺度偏向小于11%。加注的液滴经过离心可以沉降到孔板底部并交融，液滴的交融效力最高，到达99%以上。应用屡次加注样品、试剂的办法，可以完成多步反响和浓度梯度设置装备摆设。零碎加注的体积准确性、线性和重现性优越。

单细胞剖析是一项变更性技巧，在单细胞基因组异质性研讨及庞杂微生物群落中罕见微生物种群多样性研讨等范畴使用普遍。但是，若何进一步下降单细胞剖析的本钱，进步靠得住性和效力，依然面对严重挑衅。流式细胞荧光激活细胞分选（FACS）是今朝最高效的单细胞分选技巧，可完成病毒、、真菌和植物细胞的多参数检测和分选；应用荧光标志，可对分歧类型的细胞停止无效的区分，分选胜利率高。研讨团队将INJ与FACS平台相联合，树立了FACS-INJ单细胞分选剖析流程，使用笼罩了单细胞表型剖析、基因型剖析、基因表达剖析以及全基因组扩增测序。

研讨团队起首应用FACS-INJ零碎完成了病原菌微生物单细胞耐药基因的PCR筛查和单细胞药敏表型筛查。经优化，多孔板可事后装载纳升体积的PCR引物或分歧浓度的液滴。PCR筛查体积减少到500 nL，试剂耗费和本钱和惯例系统比拟下降至本来的1/40，耐药检测的体积掌握在200 nL，试剂耗费和本钱和惯例系统比拟下降至本来的1/1000，工夫从 12小时延长至5小时，这关于年夜幅下降临床病原检测的本钱，完成脑脊液、房水等难获取微量样品的耐药基因和表型筛查具有主要意义。

其次，FACS-INJ零碎还可用于植物细胞的单细胞基因表达剖析。以小鼠巨噬细胞RAW264.7在胞外多糖处置前后的炎症反响为例，经过荧光激活流单细胞式分选处置前后的小鼠巨噬细胞，基于一步法反转录及时荧光PCR扩增，在单细胞程度解析了次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶（HPRT）基因（看家基因）和白介素1β（IL-1β）基因（炎症反响）表达程度的变更。

最初，团队与北京年夜学黄岩谊课题组协作，树立了基于FACS-INJ的微生物全基因组扩增测序流程，以取得未培育微生物的全基因组信息。流程包含流式分选微生物单细胞、单细胞裂解、酸碱中和、MDA扩增和建库测序。以热泉起源的古菌硫化叶菌（Sulfolobus sp. A20）菌株为模子，将单细胞扩增的体积优化至360nL，硫化叶菌全基因组笼罩度到达80%以上。在纳进级微液滴中完成东北印度洋未培育单细胞微生物全基因组DNA的MDA扩增与测序，拼接后取得15个单细胞基因组，年夜小为0.1~3.7Mb。该办法取得的微生物基因组净化度较传统的MDA扩增办法明显下降（ 5%），明显进步了微生物单细胞基因组数据质量。平台也实用于肿瘤、胚胎等植物细胞的全基因组扩增测序，对细胞的单细胞测序的笼罩度到达60-80%。

上述研讨任务近期作为特邀论文在线揭橥在Small上。(100yiyao.com）

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