外泌体正式进入临床检验，路还有多远？

分离后的外泌体可通过多种电子显微镜进行形态学检测，如扫描电镜、透射电镜、冷冻电镜及原子力显微镜，目前研究文献中使用最多的为透射电镜；采用免疫印迹、流式细胞术等技术鉴定特异性表面蛋白标志物。外泌体是由细胞内多囊泡体与细胞脂膜融合后向细胞外分泌的囊泡，因此存在脂质双分子层结构，包括跨膜蛋白、细胞内源性蛋白、膜表面蛋白等(图1)。不同细胞来源外泌体蛋白成分存在差异。国际细胞外囊泡学会发布"证明样品中存在外泌体的最低实验要求"指导性文件中提出，采用蛋白标志物鉴定外泌体时，应同时检测到所分离样品中至少存在1个跨膜蛋白(如四次跨膜蛋白CD9、CD63，黏附分子等)、1个细胞内源性蛋白，如易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSGl01)、膜联蛋白A(annexin A，ANXA)、Rab家族蛋白(Ras-related protein Rab，Rab)，而不存在内质网来源蛋白，如钙联接蛋白(calnexin， CANX)、高尔基体基质蛋白(Golgi matrix protein，GM130) 或核蛋白[12]。

图1

外泌体结构示意图

当下外泌体研究中最棘手的问题之一是如何准确测量评估外泌体纯度。满足检测需求的外泌体纯度，是后续内容物检测的前提。目前有两种从不同维度衡量外泌体浓度的指标：(1)外泌体蛋白浓度；(2)外泌体颗粒数。外泌体蛋白浓度通常使用二喹啉甲酸微量蛋白浓度试剂盒测定，外泌体颗粒数测量方法包括光学方法如颗粒跟踪分析，动态光散射和流式细胞术[13]，以及非光学方法，如电阻式脉冲传感，透射电子显微镜和拉曼光谱[14]。目前尚不能通过单一方法准确定量外泌体纯度和浓度，未来的检测趋势是计算囊泡比率浓度(即"蛋白质与颗粒"比率)[13]。

(二)外泌体成分检测

外泌体中含有多种核酸以及蛋白类等物质，可从不同角度监测肿瘤的进展与转归预后等的关系[14，15]。每毫升血液中仅有1～10个CTC，而每毫升血液含有1×109个外泌体，含量极高。外泌体的脂膜结构对所包含的核酸分子起到良好的保护作用，具有更高的稳定性[16]。外泌体的粒径较小，通透性强，容易到达各种体液中，是液体活检的前提条件；此外所有细胞都能分泌外泌体，包括肿瘤细胞及相关的免疫细胞，故能反映微环境等多种信息。外泌体分离鉴定后，根据检测需求选取不同下游技术检测外泌体表面标记物或内容物，包括流式细胞术、质谱或二代测序等。那么何种成分检测最有可能在临床检验开展？

外泌体胞浆来源的属性决定其DNA含量很少，缺乏DNA检测信息。检测技术层面来说，蛋白不能扩增，很多重要的低丰度蛋白无法通过现有检测手段检出，蛋白检测需要寄希望于高敏感检测方法研发。外泌体内RNA可以进行扩增，目前外泌体RNA研究主要有两个方向，一种是利用测序技术直接获取RNA序列信息，另一种则是利用RNA扩增技术检测包含特定序列RNA浓度[17]。前一种需要将特定序列捕获，分离纯化再进行测序，高通量测序技术可发现新的突变，但费用较高且检测时间略长；扩增子测序则使用特定的引物对样品进行多级PCR后纯化获得特定序列进行测序，临床应用简便易行，可动态监测突变位点，但需要提前了解基因的突变信息。受益于测序技术的发展，RNA可能是有望最早成熟的外泌体成分检测技术。

然而，不管是外泌体核酸检测还是蛋白检测，最终都需要对数据进行深度分析处理以及解读。现阶段国内生物信息挖掘平台和人才，大多储备于商业性的服务企业。从短期来看外泌体测序检测只能服务于少部分经济条件允许的患者，而作为临床常规检测项目开展需要多学科的协同发展。

(三)检测质控标准

将外泌体研究成果转化为临床应用面临的关键障碍是缺乏标准化的技术规范，包括检测前(标本选择问题)，检测中(检测方法及鉴定统一标准问题，不同的内容物分析，不同检测手段)及检测后的每一个环节。

分析前质量控制，虽然处在检测标本进入实验室之前的环节，但却恰恰是最重要的环节。有明确证据表明血浆是外泌体分析最佳血液标本类型，样本收集应使用细胞稳定管或EDTA抗凝血管[18]。但其他可能影响外泌体检测的分析前多种变量，如样本收集、样本处理、储存条件和时间以及与患者有关的生物因素等，仍不明确，需要进一步研究。

任何临床检测需要以检测方法的有效性为前提，尤其要注意接近检测下限的结果。较为理想的情况是能够有标准化的样品作为比较，然而目前外泌体标准品领域几乎为空白，几乎所有外泌体研究均采用自建检测方法、自建检测区间。

高灵敏度和高特异性的检测一直是临床检验所期待的。外泌体因其独特的形成机制，丰富稳定的内容物，被誉为目前最理想的液体活检分析材料。然而高灵敏度的检测需要严格控制才能避免假阳性。由于缺乏统一的检测方法和标准，目前已公布外泌体研究结果的有效性、可重复性以及结果的通用性依然存疑。现阶段不同研究实验室使用的方法各异，检测的具体细节不同，不同外泌体检测可能无法给出相同的结果，研究结果具有不可比性。除已获批准的检测外，大多数外泌体检测方法的临床有效性和实用性缺乏相应的证据，尚需进一步研究。目前还没有确切的临床证据表明外泌体检测在之外能够用于疗效监测、早期或筛查。检测结果可比性、稳定性、有效性未明是外泌体检测进入常规临床的主要障碍。