流式（Flow）资本包：出色录制视频、罕见20问、PPT年夜放送!附彩蛋～

胞内染色染不出？找不到适合的抗体？润饰卵白不晓得怎样安慰？流式成绩层出不穷，近日，Cell Signaling Technology(CST) 做了一场备受欢送的流式细胞术线上讲座，跳出墨守成规的定律，更深层发掘试验和使用，助力科研及临床的成长。

该讲座的独到之处，在于讲解了流式的精华的同时，也带年夜家领略CST流式产物在细胞通路研讨的独到之处，错过了该出色绝伦的讲座的你，就不要再错过此次资本放送年夜礼包：讲座回放视频、现场Q A、讲座PPT、常识彩蛋等。欢送传阅！

一、讲座回放视频

点击上图，不雅看讲座视频

二、直播现场问答

请具体浏览进修，或许你也正有此疑问

Q1： 您说Fc blocking，假如我想检测CD16，还能加Fc blocking吗？

A：这个要看您Fc blocking里CD16的克隆，跟您检测用的CD16的克隆不克不及一样。别的建议预试验试一下。

Q2： 您对免疫器官比方脾脏的单细胞悬液制备有什么建议吗？后面只讲了血液和细胞系。 A：脾脏制备单细胞悬液绝对比拟复杂，只需用响应的用具将脾脏碾碎，再应用响应孔径的滤膜将单细胞滤出即可。比方可以应用打针器中的推柄将脾脏碾碎，PBS重悬后，用70 m的滤膜过滤至50 ml离心管中，离心去除上清。如需裂红，可再持续应用红细胞裂解液裂红。裂红时留意须要在冰上操作，5min 即可，工夫不宜过长，防止裂红过度。5min 后，立刻参加含有5%BSA的PBS终止裂红，再停止离心去除上清。

Q3： 您对免疫器官比方脾脏的单细胞悬液制备有什么建议吗？后面只讲了血液和细胞系。 A：脾脏制备单细胞悬液绝对比拟复杂，只需用响应的用具将脾脏碾碎，再应用响应孔径的滤膜将单细胞滤出即可。比方可以应用打针器中的推柄将脾脏碾碎，PBS重悬后，用70 m的滤膜过滤至50 ml离心管中，离心去除上清。如需裂红，可再持续应用红细胞裂解液裂红。裂红时留意须要在冰上操作，5min 即可，工夫不宜过长，防止裂红过度。5min 后，立刻参加含有5%BSA的PBS终止裂红，再停止离心去除上清。

Q4： 为什么CD8用了foxp3的破膜试剂？是外表marker不须要吧? A：这里能够听课的同窗有些曲解。讲座中关于的应用，其目标是为了验证 这些固定破膜剂在对细胞停止处置之后，会不会对响应的靶点发生影响 这个成绩。是以，并不是CD8标志的时分要应用Foxp3的破膜试剂，而是为了验证应用Foxp3固定破膜剂后，能否会影响CD8的表达。

Q5： GFP/PI做细胞周期，怎样做对比呢？ A：1. 纯真做细胞周期，由于仅染色DNA，所以不须要额定预备未染色对比。须要预备的次要是生物学对比，以验证处置办法能否会惹起细胞周期各个阶段的表示。2. 细胞周期经典的固定破膜办法照样应用乙醇。假如是应用乙醇对细胞停止处置，异样的事理，醇类的无机试剂会形成某些卵白构象的变更，乙醇也会形成GFP的构象变更，形成GFP旌旗灯号的淬灭。是以试验自己也酿成了PI单染，也无需预备荧光类的对比。3. 假如不应用乙醇固定破膜（请留意，这类办法细胞周期应用不推举），则需预备GFP单阳的细胞及PI单染的细胞来调理赔偿。

Q6： RNA 探针可以做流式检测吗？ A：今朝市情上是有专门的用流式来反省RNA的产物。然则这些探针都是经由特别设计的，有庞杂又特别的步调，并且搭配其公用的固定破膜试剂。详细的具体信息年夜家可以征询响应的品牌技巧。

Q7： TritonX-100打孔，配景荧光强度高，是怎样形成的呢？ A：这个缘由有好多，能够跟检测的靶点及抗体克隆都有关系。如讲座中的两个分歧的靶点，CD3和CD4，CD4的配景荧光就没有降低。

Q8： 某种目标卵白(如核转录因子)自己的表达程度较低，若何胜利检测出来？ A：关于表达程度较低的靶标卵白，可以经过配色来优化，比方选择亮一点的荧光染料。也可以经过选择生物素标志的一抗，再应用荧光偶联的链霉亲和素，如许可以起到缩小的感化。然则，每种检测手腕都有它的检测敏锐度的上限，假如靶标卵白表达很低，即使是优化了抗体标志，也的确是有能够检测不到的。

Q9： 在哪里能查到某种目标卵白的抗原表位是位于核内照样胞内？ A：年夜家可以应用UniProt数据库。在CST官网上，进入目标抗体页面后，在页面最下方的数据库链接里可以直接进到响应靶标的网站。

Q10： FoxP3的固定破膜试剂详细成分是什么？ A：Foxp3由于靶标自己检测的特别性，所以今朝各个品牌针对Foxp3的贸易化固定破膜试剂详细成分都是不地下的。

Q11： 请问别离单细胞悬液后，由于在安慰阶段工夫较长（4-6h），安慰后细胞又抱团，招致后续操作都是带有较年夜团沉淀操作，若何处理呢？ A：1. 假如是贴壁细胞系样品，贴壁细胞可以先安慰后，再将细胞处置（如Accutase等）成单细胞悬液。2. 假如是其他已获取的单细胞悬液，则可以用枪停止吹匀。3. 留意安慰后样品的后续步调，尽量在冰长进行，高温可以下降细胞的性命运动，在必定水平上可以维护安慰后获得的特别靶标旌旗灯号。

~ 彩 蛋 ~~ 彩 蛋 ~~ 彩 蛋 ~~ 彩 蛋 ~~ 彩 蛋 ~~ 彩 蛋 ~~ 彩 蛋 ~ 三、CST额定赠予流式中罕见成绩 Q12： 若何合理应用并查找适合的同型对比（Isotype）？ A-1：合理应用：1. 假如是阴性阳性分群分明的CD分子，抗体标志后即使没有Isotype也可以看到清晰的分群，则无需应用Isotype。2. 持续表达的靶标卵白，以及没有分明阴性阳性分群的靶标卵白，必需应用Isotype。3. CST年夜多半的靶标卵白应用流式检测时都需应用Isotype。4. 标志时，Isotype Control的浓度必需与其对应靶标抗体的浓度分歧。A-2：查找同型对比：5. 在CST官网输出响应的抗体货号，在成果表示图下方的正文中即可看到对应的同型对比。如斯种办法无法查到适合的同型对比，则请经过4006-473287 (GreatQ) 及tech@cst-c.com.cn接洽技巧支撑团队。6. Isotype的起源与亚型必需与其对应靶标抗体的起源及亚型分歧。

Q13： 若何安慰及活化靶标卵白？ A：CST官网上有十分具体的各类靶标的处置方法，年夜家可以经过以下链接停止检查并参考：假如须要更具体的信息，也可以经过4006-473287(GreatQ)及tech@cst-c.com.cn接洽技巧支撑团队。

Q14： 若何选择及合理应用逝世活染料？ A-1：胞内染料有两种，特色辨别如下：1. 细胞膜非通透性核酸染料，该类型染料的特色是，仅标志核酸，不具有膜通透性，所以无法进入细胞膜完好的活细胞，只能进入细胞膜受损的逝世细胞。长处是操作复杂，关于通俗外表染色且细胞形态较好的样品，上机前10min参加即可。这类染料的缺陷是，与核酸联合可逆，是以染色后的样品弗成固定，不然能够会形成本来活细胞的二次着色，仅合适做新颖的活细胞样本。2. 胺基联合类逝世活染料，该类型染料可以标志卵白上的胺基。这种联合是波动的，是以可以在逝世活染料标志落后行样本固定，合适胞内染色。A-2：逝世活细胞染色留意事项：1. 组织样本如消化后获得单细胞悬液，则需应用胺基类染料。2. 胺基类染料染色时，染色缓冲液需应用纯PBS，弗成含有FBS或BSA。以避免胺基类染料被非特异性联合，招致样本标志掉败。

Q15： 甲醇固定有哪些留意事项？ A：1. 样本沉淀一边涡旋，一边将-20℃预冷的纯甲醇，迟缓逐滴参加，直至响应浓度。2. 需应用程度转子停止离心，向心力500 g。

Q16： 当检测的靶标既有外表又有胞内卵白时该若何肯定适合的试验步调？ A：1. 起首，剖析胞内样品能否须要安慰，安慰的工夫年夜约到多久。假如安慰工夫很短，则需先辈行逝世活染料的标志，然后安慰样品，完成安慰后最好即刻停止固定。2. 检查固定试剂对外表待测靶标的影响。假如固定会惹起外表待测靶标的抗原位点被掩蔽，则需先辈行外表靶标的标志再固定。3. 依据胞内待测靶标肯定可以应用的破膜的试剂。4. 检查破膜试剂的特征，并肯定它对外表待测靶标及响应荧光染料的影响。经过此步调来肯定外表染色这一环节是放在破膜前照样破膜后。5. 请切记，胞内染色原本就不是一个复杂的进程，每个分歧的panel都须要重复的探索测验考试，从而才干获得最佳的染色步调，取得幻想的染色后果。

Q17： CST关于胞内染色的经历分享可以在哪里找？ A：可以在以下链接 ，查找抗体克隆信息和试验步调兼容性测试信息。

四、最初魂魄三问的总结 Q18： 为什么我的样本标志不上抗体？ A：1.肯定应用的抗体是可以用于流式试验的。2. 分歧的试验步调（尤其是固定破膜的办法）能够会影响抗体的功能及卵白的构象。3. 假如有能够，请尽量懂得靶标卵白的生物学特征。

Q19： 怎样才干让样本标志上抗体？ A：1.应用抗体阐明书中已验证过的试验计划。2. 一个抗体能够有分歧的试验办法，针对立体的抗原位点及试验，选择最适的办法3. 胞内抗体须要破膜，分歧抗体的破膜剂须要重复探索后确认。

Q20： 胞内卵白与CD分子同时标志时需留意什么？ A：1. 肯定CD分子的克隆，选择最适的固定破膜剂。2. 部门破膜剂会形成荧光基团的淬灭，组合选择适合的荧光基团与破膜剂。3. 肯定CD分子标志的最佳环节。

此次讲座，播种好评有数

教师，讲的真好

请问有回放吗？

好凶猛呀，照片也很美观，很专业哦

好专业啊

请问这个ppt可以会后分享一下吗？

每次讲座真出色

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