基因表白动静示踪的新技术研讨获停顿

Nature Cell Biology在线颁发了研讨论文《通过内源性启动子驱动的sgRNA监测低品貌转录本和lncRNAs的表白》，该研讨由中国迷信院脑迷信与智能技术杰出立异中间（神经迷信研讨所）、上海脑迷信与类脑研讨中间、神经迷信国度重点试验室研讨员杨辉研讨组和研讨员周海波研讨组单干实现。研讨通过内源基因的启动子驱动sgRNA（single-guide RNAs）表白，联合SPH-OminiCMV（CRISPR-activator Suntag-P65-HSF1 and OminiCMV-mCherry）荧光申报体系，完成低品貌基因和lncRNAs（Long non-coding RNAs）基因表白的动静示踪，树立了一种通用的内源基因转录门控体系，为活细胞中及时标志低表白基因和lncRNAs，研讨其生物学功效提供了无效对象。

在活细胞中及时监测内源基因活性对研讨基因的生物学功效并调控其表白程度至关紧张。近年来，越来越多研讨标明，lncRNAs通过调控某些紧张编码基因的表白，不仅参加了脑发育、神经元分解、突触可塑性的产生倒退，并且参加了神经体系毁伤之后的修复进程。深化研讨lncRNAs，将为医治神经体系疾病提供新思绪。然而，受现有标志技术的限定，对其功效正文具备挑战性。

监测内源基因活性的惯例办法是将荧光卵白准确拔出卵白编码框中，但这种办法不实用于非编码基因和低品貌转录的基因。sgRNA，相似于一个GPS可以将Cas核酸酶间接导向目的核酸位点，具备高特同性、高效率和多功效性。虽然各类诱导性sgRNA已被开辟用来接管活细胞中的内源旌旗灯号，但这些办法只能用于某些功效明白的小RNA的反馈。今朝在活细胞外面标志内源基因表白的办法存在局限性，且关于低表白的基因以及lncRNA，缺乏很好的活细胞内的标志技术。树立实用范畴更广、可加强内源旌旗灯号、且信噪比更低的新型活细胞标志技术是该研讨畛域急需解决的成绩。

杨辉研讨组和周海波研讨组单干开辟了一种广谱的内源性转录门控开关Ents（Endogenous Transcription-Gated Switch），应用内源性启动子表白sgRNA前体，之后sgRNA前体上的tRNA序列可被内源的自剪切机制辨认而且切割，进而开释出可能执行功效的sgRNA，当Ents与高度敏感的CRISPR激活相关的申报体系SPH-OminiCMV联合，可以监测到内源基因的表白（图A）。SPH-OminiCMV-Ents可能缩小内源旌旗灯号，从而完成低品貌转录本表白的可视化。

为进一步研讨SPH-OminiCMV-Ents用于监测内源基因的才能，科研职员拔取了表白量从高到低的八个基因，发现SPH-OminiCMV-Ents诱导的mCherry表白程度广泛高于罕用的P2A-mCherry标志战略，尤其是P2A-mCherry战略标志后在荧鲜明微镜下简直无旌旗灯号的低品貌表白基因Sox2、Tet1、Sall4、Tbx3等（图B）。

为探讨添加sgRNA拷贝数是否会进一步加强荧光卵白的发生，科研职员构建了一个sgRNA前体，包括六到八个串联的sgRNA拷贝，每个sgRNA的两侧散布着tRNA序列（图C）。研讨标明，拔出sgRNA阵列可以对低品貌基因完成更好的监测，比方lncRNA Tug1，当仅用一个拷贝的sgRNA的时分不克不及监测到其表白，但使用sgRNA阵列则可以（图D，E）。为进一步探讨此办法的个性，科研职员树立了一个可控的Tet-on体系，该体系可以通过调理Dox的浓度，完成EGFP基因分歧水平的表白量，进而用来研讨申报体系的荧光旌旗灯号强度是否可以较好地反映目的基因的表白程度。研讨发现，申报体系的mCherry表白量和EGFP基因的表白量有较强的相关性，而且进一步摸索了此申报体系和目的基因表白在转录本程度和卵白翻译程度存在的光阴差（图F）。为探讨此体系是否能跟着基因表白量的增高，其申报体系也能监测出旌旗灯号加强的变动。科研职员拔取了表白量在小鼠胚胎中表白量低，但体外分解成神经元后表白量会增高的Tubb3基因。研讨标明，分解后Tubb3的基因表白量不论是mRNA照样卵白程度的表白量均增高，申报体系中的赤色荧光旌旗灯号也随之增高，可能反映基因表白的动静变动。 (100yiyao.com）