Genome Biology：开辟出单细胞基因组单分子测序新办法

单细胞全基因组测序技术（scWGS）可以无效提醒生物样品中分歧细胞之间的异质性，并体系鉴定单个细胞的基因组中产生的遗传变动，例如拷贝数变异（CNV）和点渐变（单核苷酸变异，SNV）等。过来十年，研讨职员曾经开辟出多种单细胞基因组扩增技术，例如简并寡核苷酸引物PCR扩增技术(DOP-PCR)、多重置换扩增技术（MDA）、多重退火和基于环的扩增轮回技术（MALBAC），以及通过转座子拔出和体外转录进行线性扩增技术（LIANTI）等。然则，今朝的单细胞全基因组测序技术均基于二代测序（NGS）平台，该平台检测精确度高，然则测序读长绝对较短（通常只有150bpX2），次要实用于检测单个细胞中的单核苷酸变异（SNV）、小的拔出缺失（ 50bp，Indel）以及拷贝数变异（CNV）等。因为二代测序平台读长的限定，关于基因组中构造变异的检测具备很年夜的局限性。构造变异（包含拔出、缺失、反复和易位等）是人类体细胞变异的次要起源之一，对的产生、倒退和转移具备潜在的驱举措用，然而今朝在单个细胞程度对基因组构造变异的研讨却鲜有报道。

针对基于二代测序平台的单细胞基因组测序技术难以高效鉴定单个细胞中构造变异这一天下难题，北京将来基因高精尖立异中间、北京年夜学生物医学前沿立异中间汤富酬课题组在Genome Biology上在线颁发了题为“SMOOTH-seq： single-cell genome sequencing of human cells on athird-generation sequencing platform”的研讨论文，在国内上率先开辟了基于三代测序（单分子测序）平台的单细胞基因组测序技术。

该研讨的次要突破有：

开辟了一种高精度的基于三代测序（单分子测序）平台的单细胞基因组测序办法——SMOOTH-seq（Single-MOlecule real-time sequencing of LOng Fragments amplified THrough Transposon insertion）。使用优化后的Tn5转座反馈，SMOOTH-seq可能从单个细胞中扩增出均匀长度约6kb的基因组片断（测序读长比单细胞基因组二代测序技术长了20倍左右），通过引入与单分子测序平台兼容的细胞条形码使单细胞基因组DNA扩增子实用于Pacbio sequel II平台的HiFi测序形式。测序后的数据中，发生的环化测序（circular consensus sequencing， CCS）的读长均匀在6kb左右， 最长可达43kb。

该研讨开辟的SMOOTH-seq办法可能在单个细胞中高效检测基因组构造变异。在单个K562细胞中，当测序深度仅为0.4X时，基因组笼罩度可达19%。该研讨对91个单细胞进行SMOOTH-seq阐发，从中检测到4，790 个缺出事件和5，589个拔出变乱，此中87%的缺失片断和91% 的拔出片断长度小于1kb，检测到的拔出变乱DNA片断最长到达7.7kb。同时，该研讨也在K562细胞中检测到521个易位变乱，包含精确检测到两对经典交融基因：BCR-ABL 和NUP214-XKR3。SMOOTH-seq技术对构造变异的检测精度高，当使用K562年夜量细胞的基因组三代测序成果作为比拟基定时，该研讨中使用的K562细胞系的每个单细胞中的构造变异检测均匀准确度为75％，特殊是在单个细胞中检测拔出变乱均匀准确度为85％。此外，SMOOTH-seq 也可以以1Mb 的分辩率精确检测到两个K562克隆之间的分歧拷贝数变异（CNV）变乱。

该研讨开辟的SMOOTH-seq办法可能在单个细胞中高效检测染色体外环形DNA（ecDNA）。已有的研讨报道标明，染色体外环形DNA在肿瘤产生中比拟罕见，且致癌基因可能在染色体外环形DNA中进行年夜量扩增，匆匆进产生和转移。SMOOTH-seq技术发生的长读长数据，使其可能被用于在单个细胞中精准捕捉小于10kb的全长染色体外环形DNA。本研讨同时开辟了用于鉴定K562细胞系中的染色体外环形DNA的阐发办法。当仅有一个拷贝的Tn5转座酶与一个染色体外环形DNA分子联合时，整个环形DNA分子就可被完全扩增为一个线性片断，即单个读段即可笼罩一个染色体外环形DNA分子的全长序列。通过统计Tn5拔出地位分歧但长度完整雷同的一组读段，即可判断它们是否起源于统一个环形DNA。同时该特征可用于帮忙精准区分染色体外环形DNA和串联反复序列(如图3所示)。

该研讨开辟的SMOOTH-seq办法能以较高精确度检测基因点渐变（SNV）。

该研讨开辟的SMOOTH-seq办法可以在结直肠癌肿瘤样本中精确检测出各类基因组构造变异变乱。在对患者结直肠癌肿瘤样本的阐发中，以在结直肠癌的至多2个单细胞中同时检测到为尺度，该研讨检测出8，594个构造变异变乱（4，089个拔出变乱，3，852个缺出事件，341个易位变乱，以及312个反复变乱）。通过将结直肠癌肿瘤样本和K562细胞系中共有的构造变异去除后，该研讨共获得3，570个结直肠癌肿瘤细胞特同性的构造变异变乱(1，376 拔出变乱， 1，661 缺出事件， 230 易位变乱以及303 反复变乱)。同时，该研讨通过设置多个对照基因组（包含响应的肿瘤组织、与肿瘤相邻的正常组织、GM12878细胞系和另一个别的外周血单核细胞的基因组）对检测出的构造变异变乱进行了PCR验证。此外，该研讨发现结直肠癌样本和K562细胞系中共有的构造变异在一切被检测的多团体类基因组DNA样品中均存在，阐明这些构造变异变乱理论上是因为以后的人类参考基因组不够欠缺，缺失了部门症结序列信息惹起的。往后三代测序将有助于组装出更完全精准的人类参考基因组序列（ bioon）