脱氧核糖核酸甲基化与癌症的NGS检测

甲基化检测的NGS方法和过程

随着高通量测序技术的发展，NGS(下一代测序)已经成为一种可以快速获得任何物种DNA甲基化模式的检测方法。除了检测全因组范围内的甲基化水平外，还可以进行DNA富集和测序，如MeDIP或MBD Cap(也称为MeDIP-seq或MBD-Cap-seq)。甲基化的DNA片段被特异性抗体或蛋白质捕获，经纯化、扩增等步骤后测序。然而，这种检测方案不能准确识别单个位点的甲基化水平，通常用于评估特定区域的甲基化水平。类似地，基于限制性内切酶的预处理方案，称为MSRE(MSRE-seq)，使用对甲基化位点敏感的限制性内切酶(BstUI、HpaII、NotI和SmaI)切割非甲基化限制性位点，并在纯化、扩增等步骤后测序。由于上述两种方法都具有较低的检测分辨率和基因组覆盖率，它们在该领域的临床应用，尤其是在癌症的早期筛查和早期诊断方面[8]。

亚硫酸氢盐处理一直是绘制DNA甲基化图谱的金标准。澳大利亚Kanematsu等科学家开发的技术方案[10，11]，经过亚硫酸氢盐处理后，DNA的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶残基，而5-甲基胞嘧啶(5mC)保持不变。各种检测方案对比见下表[9]:

如果我们想在大量样本的特定区域检测甲基化，WGBS无疑会成为一个成本相对较高的技术方案。幸运的是，杂交捕获技术可以在一次反应中检测出数千至数百万个目标基因组序列碱基，这提供了一种经济高效的解决方案，如果成本允许，可以实现更高的测序深度和更大规模的研究。

甲基化文库的常规制备方法如下图流程B所示。DNA在连接反应步骤中加入测序接头，然后转化为可在计算机上测序的文库，然后用复盐硫酸盐处理，也称为PreBS(预亚硫酸氢盐)法。这种方案通常需要至少微克级的DNA，主要原因是亚硫酸氢盐处理会破坏DNA的双链结构，使得受损的文库在测序过程中无法生成簇。文库序列信息或独特分子的丢失限制了人类疾病研究的样本类型，如游离核酸。即使低初始DNA样本最终转化为可以在计算机上使用的测序文库，由于重盐硫酸盐处理，文库的分子复杂度极低，影响最终测序质量，如dup率高。

为了解决上述问题，亚硫酸氢盐处理后建立数据库的技术方案逐渐成为主流检测路线，即PostBS(后亚硫酸氢盐)和PBAT(后亚硫酸氢盐配体标记)也属于这种方法(流程C)。PBAT以亚硫酸氢盐转化的单链DNA为初始模板，用两轮随机引物延伸，从而连接两端的测序接头。由于随机引物的使用，它使得：

1.亚硫酸氢盐处理后产生的一定比例的受损DNA模板不能结合引物，从而降低测序文库的分子复杂性；

2.随机扩增有模板偏好。

值得注意的是，PBAT方案的改进版本也被用于单细胞甲基化分析方案。

Swift Biosciences(被IDT爱德公司收购)创造了一个更优化的PostBS数据库构建流程，与PBAT一样，以亚硫酸氢盐转化的单链DNA为初始模板；不同的是，IDT xGen甲基-序列文库制备(原名Accel-NGS甲基-序列文库试剂盒，Adaptase技术)在亚硫酸氢盐转化后，最大限度地利用和转化了单链和受损的DNA，从而提供了一个更完整和不太优选的甲基化文库(流程A)。

IDT xGen Methyl-Seq Library Prep基于Adaptase专利技术，是一种高效的不依赖模板的单链DNA接头连接方法。本发明提高了文库转化的效率，使亚硫酸氢盐转化后的DNA样品与测序连接器连接，实现了样品组成的准确呈现。亚硫酸氢盐转化后的单链和受损DNA通过高效连接进行文库构建。与构建文库再进行亚硫酸氢盐转化的方法相比，文库的产量可提高100倍。此外，利用IDT独有的非选择性接头连接方法，经WGBS(全基因组亚硫酸氢盐测序)验证，xGen Methyl-Seq Library Prep甲基化文库试剂盒可以提供更完整的NGS文库，且偏好性更低。

新加坡南洋理工大学的周莉等人系统比较了三种PostBS文库制备试剂盒的性能，包括Xgen甲基-seq文库制备、Illumina Tru seq DNA甲基化试剂盒(PBAT)和Qiagen Qiaseq甲基文库试剂盒(PBAT) [12]。实验的设计如下表所示。样品1-4和5-8是全血和白细胞亚群(样品5和8: CD4 T细胞；样品6和7:中性粒细胞)

研究团队评估了包括测序质量(Q20、Q30、低质量碱基去除率等)在内的测序指标。)、文库质量(平均插入片段大小、重叠区域比率、dup率等)。)，覆盖率(平均有效排序深度、覆盖均匀性、CpG站点覆盖率)等。下面的热图综合了图书馆建筑三种准备方式的整体性能对比结果，其中“绿色”和“红色”如果两个具体指标没有统计上的显著差异，那么这两种方式将被赋予相同水平的平均性能。比如在评估Q20测序指标时，IDT xGen Methyl-Seq Library Prep和TruSeq是表现最好的试剂盒，评分也是一样的(2.5=(2 3)/2)，因为两者之间没有统计学上的显著差异。

摘要

甲基化测序是研究细胞分化、疾病进展等不同生命过程中基因调控的重要工具，越来越多地应用于临床领域，包括肿瘤早期筛查、分诊、治疗方案选择、微量残留监测、复发检测等。体液样本，包括游离核酸，含有来自的特异性DNA甲基化信号，无疑是作为样本检测来源的绝佳选择。

亚硫酸氢盐处理一直是绘制DNA甲基化图谱的金标准。由于其转化效率的稳定性，保证了后续甲基化检测结果的准确性。当检测特定目标区域的大样本量时，WGBS成为成本相对较高的技术方案。混合捕获技术，结合PostBS单链数据库构建过程，可以准确研究感兴趣的目标区域。(100医学网络生物)

参考文献：

1.Skvortsova K，et al . ThE NameThEnticationLandscapecer .生物化学论文。2019年12月20日；63(6):797-811.

2 .无细胞脱氧核糖核酸的表征。无细胞脱氧核糖核酸作为诊断标记第129-135页。

3.作为检测母体血浆中胎儿脱氧核糖核酸策略的胎儿和母亲间差异脱氧核糖核酸甲基化。克琳。化学。2002, 48, 3541.

4.香港中文大学王教授；肝癌患者血浆和血清中异常p16甲基化的检测。癌症研究1999，59，71-73。

5.111个参考人类表观基因组的综合分析。自然2015，518，317330。

6.利用无细胞DNA甲基化标记进行敏感和特异的多癌检测和定位。安肿瘤科。2020年6月；31(6):745-759.

7.在结直肠癌患者中使用仅血浆循环肿瘤脱氧核糖核酸检测的最小残留疾病检测。安肿瘤科。2020年9月；31(9):1266-1267.

8.洛克WJ等，脱氧核糖核酸甲基化癌症生物市场：转移到诊所。正面遗传。2019年11月14日；10:1150.

9.VivekKumar等(2019)人类癌症检测中表观遗传生物标志物的研究技术/工具生物医学工程及其在health carep 327-351中的应用

10.弗洛默等人(1992年)。一种基因组测序方案，在单个脱氧核糖核酸链中产生5-甲基胞嘧啶残基的阳性显示。继续。纳特。阿卡德Sci .美国89 (5),1827-1831。

11.克拉克、哈里森、保罗和弗洛默(1994)。甲基化胞嘧啶的高灵敏度明。核酸第22 (15)号决议，29902997

12.周莉等(2019)高通量全基因组亚硫酸氢盐测序的文库制备方法和测序平台的系统评价Sci .代表七月17日；9.

xGen甲基序列文库制备试剂盒订购信息

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核心套件

10009860

xGen甲基序列文库制备，16rxn

16种反应

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xGen甲基序列文库制备，96 rxn

96个反应

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xGen甲基序列文库制备4x96 rxn

384个反应

独特的双索引引物板

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xGen UDI引物对，索引1-16

16种反应

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xGen UDI引物对，索引1-96

96个反应

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xGen UDI引物板2，8nt

96个反应

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xGen UDI引物板2，8nt 4x96

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xGen正常酶单方面宣布独立引物组一

384个反应

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