Nature Biotechnology:开发出高效新开机编辑器的“升级版”

Prime Editor (PE)是一种新型的基因组编辑工具，可以实现基因组目标位点的任意碱基替换、缺失和小片段插入，是基因组编辑领域的一次重大革命。2020年，中国科学院遗传与发育生物学研究所团队通过探索逆转录酶、工作温度、pegRNA的表达形式、PBS和RT模板序列长度等不同条件，在水稻和小麦中建立了并优化了一个植物引物编辑器(PPE)(林等，Nature Biotechnology，2020)。随后，研究团队建立了基于解链温度(Tm)指导的PBS序列设计方案，提出了双pegRNA策略，并进一步开发了植物pegRNA设计网站PlantPegDesigner，提高了指导编辑效率，简化了植物PEG RNA的设计过程(林等，Nature Biotechnology，2021)。此外，团队还通过全基因组重测序发现PPE系统在全基因组水平上具有较高的特异性(金等，Nature Biotechnology，2021)。这些研究为指导编辑系统在植物领域的应用打下了良好的基础。然而，目前植物中的引导编辑系统的编辑效率仍然不够高，并且具有很大的目标依赖性。这些缺点限制了引导编辑在植物中的广泛应用。因此，如何优化引导编辑系统，突破现有的局限性，提高引导编辑技术的效率和适应性，仍然是该领域的研究热点。

近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组及其合作者发表研究成果，在植物中建立了一个更高效、应用更广泛的新型指导编辑系统EPPE(Engineered Plant Prime Editor)。与大多数报道的通过优化pegRNA来提高引导编辑效率的想法不同，本研究侧重于对引导编辑系统的蛋白质组分进行修饰。通过筛选含有不同逆转录酶M-MLV RT变异体的候选PPE系统，融合不同的病毒相关蛋白，发现删除M-MLV RT的RNase H结构域或融合M-MLV RT的N端核衣壳蛋白(NC)可分别提高PPE的编辑效率2.0倍和3.2倍。推测RNase H结构域的去除稳定了sgRNA-DNA和NCS9-RT-PEGRNA复合物中的RNA-DNA异源双链体结构，NC蛋白通过其核酸退火活性辅助MLV-RT进行逆转录。此外，通过集成上述两种优化策略，开发了ePPE的升级版本。与PPE相比，在各种编辑类型下，如碱基替换、小片段的插入和删除、较大片段的插入和删除，ePPE的编辑效率平均可提高5.8倍，且不增加脱靶和副产物的发生。此外，当新的boot编辑器ePPE与本研究组之前报道的双pegRNA策略刘中达等人，自然生物技术，2021)和epegRNA(工程化pegRNA)策略(Nelson等人，自然生物技术，2021)进行比较时，可以进一步提高引导编辑系统精确编辑内源基因的效率。利用ePPE系统，创造了抗咪唑乙烟酸和烟嘧磺隆的水稻新材料。

专注于改造PPE的蛋白质成分，开发新的引导编辑系统ePPE，可以实现植物中的高效编辑。实践证明，结合ePPE和现有的pegRNA优化策略，可以进一步提高编辑效率。该系统有望促进指导性编辑器在农业育种和作物改良中的应用。相关研究成果在线发表于《自然生物技术》(doi: 10.1038/S41587-022-01254-W)。研究工作得到了国家和中国科学院战略性先导科技专项(A类)的支持。中国科学院遗传发展研究所曹晓枫课题组和上海科技大学黄行许课题组参与了研究。

新型高效植物指南编辑器ePPE的建立与应用。(a-b，原生质体报告系统筛选候选植物指南编辑系统，C，基于RNase H结构域缺失和NC蛋白融合的指南编辑器与PPE的编辑效率比较，D，ePPE示意图，E，四种不同指南编辑器的编辑效率比较，F，ePPE与已报道的pegRNA优化策略的编辑效率比较，G，ALS-W548M水稻突变体在不同除草剂处理下的表型)