《自然·癌症》:中国科学家发现一种新方法 专门清除胃肠道癌细胞

来源：奇点蛋糕2022-04-30 08336047

胃肠道肿瘤(GIC，包括胃癌、胰腺癌和结直肠癌)和神经内分泌肿瘤(NET)一旦发生转移，治疗手段有限，预后差。全世界每年大约有500万新的GIC病例，

胃肠道肿瘤(GIC，包括GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC，GIC全球每年约有500万GIC新发病例，GIC相关死亡占所有癌症相关死亡的35%[1]。因此，寻找新的治疗方案是临床急需解决的问题。

近年来，肿瘤治疗取得了突破性进展，尤其是嵌合抗原受体T细胞(过继细胞)疗法具有显著的治疗效果[2]。然而，CAR-T对GIC和NET等实体肿瘤的治疗仍处于空白阶段，部分原因是缺乏合适的肿瘤特异性抗原和相应的单克隆抗体。因此，探索安全、可靶向的肿瘤特异性抗原是解决这一挑战的关键。

最近，美国宾夕法尼亚大学的华贤信教授及其团队从美洲驼中分离出一种纳米抗体(VHH1)，它可以与人类肠道上皮细胞和部分胰腺导管上皮细胞表面的肝肠钙粘蛋白17(CDH17)结合。VHH1-CAR-T细胞(CDH17CAR-Ts)能以CDH17依赖的方式消除人和小鼠肿瘤细胞。

特别是，虽然CDH17在健康组织细胞中也有表达，但正常细胞表面的CDH17位于肠上皮细胞之间的紧密连接处，受到保护免受CDH17CAR-Ts攻击[3]。

本研究表明，CDH17是GIC和NET嵌合抗原受体T细胞治疗的理想靶点，为进一步探索肿瘤相关抗原和开发实体肿瘤的安全免疫治疗提供了新思路。相关研究成果近日发表在著名期刊《自然 癌症》 (Nature Cancer)上。

论文的第一页

接下来，我们来看看这个研究是如何进行的。

首先，为了探索可用于免疫治疗的GIC-NET特异性抗体，研究小组利用未感染的美洲驼外周血单核细胞构建VHH(纳米抗体)噬菌体文库，通过筛选分离出与NET特异性结合的VHH1。

为了识别VHH1靶向的蛋白抗原，研究人员制备了3000个人类细胞膜蛋白的互补DNA片段，转染到HEK293T(人胚胎肾细胞)细胞中，然后用表达VHH1的噬菌体进行筛选。发现VHH1只与细胞表面粘附蛋白CDH17结合。

CDH17，也称为肝肠钙粘蛋白，是一种具有七个胞外钙粘蛋白(EC)结构域的细胞粘附蛋白。它主要在肠上皮细胞和一些胰腺导管上皮细胞中表达，在GIC和净肿瘤细胞中表达上调。

接下来，研究人员用具有7个单结构域突变的CDH17突变体转染细胞，然后使用流式细胞仪检测与VHH1的结合。研究发现，EC1结构域缺失的CDH17突变体失去了与VHH1结合的能力，表明VHH1特异性结合EC1结构域。

随后，研究人员对35例NET患者的肿瘤组织进行了免疫组织化学染色(IHC)。结果显示在35个样本中有19个(54.3%)高度表达CDH17。其中，14个小肠来源的净肿瘤组织中有12个(85.7%)为CDH17阳性，而15个胰腺来源的净肿瘤组织中有6个(40%)为CDH17阳性。净肿瘤细胞在肿瘤中是异质性的，一些肿瘤细胞失去了CDH17的表达，但在19个CDH17阳性样品中的13个中，超过90%的肿瘤细胞高表达CDH17。

上述数据表明，CDH17是开发CAR-T疗法以治疗NETs和其他胃肠肿瘤的合适靶标。

分离出VHH1并证明其特异性结合在NETs中高表达的CDH17。

那么，VHH1能否引导T细胞杀死净肿瘤细胞呢？

首先，研究团队构建了CDH17特异性嵌合抗原受体T细胞：VHH1-CAR-T细胞(CDH17CAR-Ts)。研究表明，T细胞与靶细胞之间的距离对于免疫突触的形成以及随后对靶细胞的杀伤至关重要[4]。

因此，研究人员构建了五种不同铰链长度的嵌合抗原受体(car):h38 car(铰链区IgG3c8)、H3CAR(铰链区igg3)、H8CAR(铰链区CD8)、H3sCAR(铰链区IgG 3)和H4CAR(铰链区IgG4)。然后，他们将这五种car和空载体分别转导到人T淋巴细胞株JRT3中。结果表明，短铰链CAR(CD8、IgG 3和IgG4)转导的JRT3能有效杀伤BON细胞(人胰腺神经内分泌肿瘤细胞)，但对BT474细胞(人乳腺导管癌细胞)无杀伤作用。

接下来，研究人员用不同铰链长度的CARs转导人类初级T细胞，得到了相同的结果。用H4CAR(IgG 4的最短铰链区)转导的t细胞对肿瘤细胞的杀伤效果最好。

这些结果表明，用短铰链转导的VHH1-CAR-T细胞可以特异性杀伤人胰腺神经内分泌肿瘤细胞。

筛选特异性有效杀伤NETs细胞的嵌合抗原受体T细胞

接下来，为了探索是否可以进一步增强VHH1-CAR-T杀伤实体肿瘤的功效，分别构建了仅含有4-1BB共刺激结构域的第二代VHH1-CAR(VHH1-BBz)和含有CD28和4-1BB共刺激结构域的第三代VH h1-CAR(VH h1-28 BBz)。

然后，用CDH17慢病毒转导人细胞(SKOV3细胞)，并进一步筛选出表达CDH17的SKOV3细胞。然后用VHH1-BBz-CAR-T和VHH1-28BBz-CAR-T分别用野生型SKOV3细胞(WT-SKOV3细胞)和CDH17-SKOV3细胞(CDH17-SKOV3细胞)表达CDH17。

结果表明，两种VHH1-CAR-T在体外均能有效杀伤CDH17-SKOV3细胞。值得注意的是，VHH1-28BBz-CAR-T在杀死CDH17-SKOV3细胞方面比VHH1-BBz-CAR-T更有效。同时，与CDH17-SKOV3细胞共培养时，VHH1-28BBbZ-CAR-T释放的干扰素(IFN)和肿瘤坏死因子(TNF)比VHH1-BBz-CAR-T多，但与WT-SKOV3细胞共培养时，两种嵌合抗原T细胞未发现对肿瘤细胞有任何杀伤作用并释放细胞因子，说明CDH17诱导了CAR。

为了进一步评估两代VHH1-CAR-T在体内以CDH17依赖性方式抑制SKOV3异种移植瘤的效果，将WT或CDH17-SKOV3细胞分别移植到NSG小鼠中，然后将UTD)T细胞和两代VHH1-CAR-T分别注射到小鼠中。

结果显示，对照组中注射了UTD T细胞的小鼠的肿瘤呈指数增长。第二代VHH1-BBz-CAR-T注射液能显著抑制肿瘤生长，但不能根除肿瘤。第三代VHH1-28BBz-CAR-T注射液可特异性根除CDH17-SKOV3肿瘤，延长总生存期，但不影响CDH17阴性WT-SKOV3肿瘤的生长。上述结果与流式细胞仪分析结果一致。注射第三代VHH1-28BBz-CAR-T的荷瘤小鼠外周血CD3 T细胞数量最高。

一系列实验表明，第三代VHH1-28BBz-CAR-T可以通过靶向CDH17依赖性来根除体内实体瘤。

CDH17CAR-Ts可在体内消除表达CDH17的SKOV3实体瘤

随后，研究人员使用一种新的分化良好的人类胰腺神经内分泌肿瘤细胞(NT-3)进行进一步验证。体外细胞毒性试验表明，VHH1-BBz-CAR-T和VHH1-28BBz-CAR-T均能在体外杀伤NT-3细胞，第三代VHH1-28BBz-CAR-T对NT-3的杀伤作用更强。

进一步的体内动物实验表明，VHH1-BBz-CAR-T能抑制NT-3肿瘤的生长，但不能消除肿瘤。值得注意的是，VHH1-28BBz-CAR-T在体内消除了NT-3肿瘤。

研究人员在人胰腺癌细胞系ASPC1和HPAFII以及两种胃癌细胞系SNU-16和SNU-5中进一步验证了上述实验结果。

免疫组织化学染色和免疫荧光(IF)染色显示，在注射了UTD T细胞的小鼠的肿瘤组织中检测到胰岛样NT-3肿瘤细胞。注射第二代VHH1-BBz-CAR-T的小鼠的NT-3肿瘤周围有大量小而密集的T细胞，而注射第三代VH H1-28 BBZ-CAR-T的小鼠未检测到NT-3肿瘤细胞，此外，注射VHH1-28BBz-CAR-T后，部分小鼠的肿瘤大小暂时增大，这可能是由于CAR-T迁移至肿瘤部位后增殖并释放细胞因子所致。

上述结果表明，第三代VHH1-28BBz-CAR-T肿瘤在浸润和清除NET和GIC肿瘤细胞方面比第二代CAR-T更有效。

值得注意的是，与第二代CAR-T治疗后小鼠体重中度减轻相比，第三代CAR-T治疗后未观察到明显的体重减轻；第一次注射CAR-T后第10天左右，小鼠肠道未见明显损伤。在用第二代VHH1-BBz-CAR-T治疗的小鼠中，肿瘤缩小伴随体重减轻的原因仍不清楚。

此外，与注射UTD T细胞和VHH1-BBz-CAR-T相比，用VHH1-28BBz-CAR-T处理的小鼠循环血中CD3 T细胞数量最高。

CDH17CAR-Ts对小鼠NT-3肿瘤的杀伤作用

然而，当研究人员使用BON细胞进一步验证上述结果时，他们发现VHH1-28BBz-CAR-T可以显著抑制小鼠BON细胞形成的异种移植瘤，但不能消除肿瘤。因此，VHH1-CAR-T以依赖CDH17的方式杀死肿瘤细胞。然而，并非所有表达CDH17的肿瘤细胞都对car-t介导的杀伤同样敏感，BON细胞对CAR-T敏感性降低的机制值得进一步研究。

CAR-T疗法面临的一个重要问题是它对健康细胞的靶向毒性。CDH17在净肿瘤细胞中高度表达，但它也在人和小鼠肠上皮细胞中表达。那么，CDH17CAR-T在体内杀死肿瘤细胞的同时，是否也杀死了健康的肠道上皮细胞呢？

为了探索这一问题，研究小组首先测试了小鼠作为评价CAR-T疗法对正常细胞的细胞毒性的可行性，并构建了小鼠版本的VHH1-28BBz-CAR(mCAR)。

随后，研究人员原位建立了原发性结直肠癌(CRC)小鼠模型，给CRC小鼠注射mUTD T细胞或MVHH 1-28 BBZ-CAR-T；在研究结束时，将小鼠杀死并解剖，在对照小鼠中显示出明显的肿瘤，并且用mCAR-T治疗的小鼠的肿瘤负荷降低。对对照组和CAR-T治疗组小鼠肿瘤总体积的定量分析表明，CAR-T注射显著减小了肿瘤体积。进一步的组织学研究表明，注射mCAR-T的小鼠肿瘤中浸润的CD3 T细胞明显多于注射mUTD T细胞的小鼠。

总之，这些实验结果表明，MVHH1-28BBbZ-CAR-T能显著降低原发性大肠癌的肿瘤负荷，肿瘤部位T细胞浸润明显增加。

CDH17CAR-Ts可显著降低野生型C57BL/6J小鼠原发性结直肠癌的肿瘤负荷。

上述结果证实了VHH1能与人和小鼠的CDH17结合，得到的CAR-Ts也能有效杀伤小鼠肿瘤细胞。接下来，研究人员收集了用VHH1-CAR-T治疗10天的NT-3肿瘤NSG小鼠的UTD T细胞或健康组织。免疫组织化学染色显示，经VHH1-CAR-T处理后，小肠和结肠完好无损，这些健康组织无明显组织损伤。此外，在胰腺、胃、心脏、肝脏和肾脏中未观察到明显的组织损伤。

最后，研究人员通过免疫荧光(IF)染色检测到人类CAR-T渗入正常小鼠的小肠和结肠。结果显示，在用VHH1-T治疗的小鼠中，在具有高CDH17-CAR-T表达的NT-3肿瘤中观察到大量的T细胞，而在注射了UTD T细胞的小鼠中没有观察到。

值得注意的是，当用UTD T细胞或VHH1-CAR-T处理具有隐蔽的CDH17表达的NT-3肿瘤时，在小鼠的小肠或结肠中没有发现T细胞浸润，尽管受体小鼠的正常组织具有丰富的CDH17表达。为了确保VHH1能与健康小鼠组织中的内源性CDH17结合，研究人员使用VHH1和兔抗VHH抗体进行IF染色，发现VHH1确实能与表达CDH17的NT-3肿瘤和表达正常CDH17的小鼠肠上皮细胞结合，但不能与CDH17阴性的胰腺或胃细胞结合。

值得注意的是，CDH17主要表达在小鼠肠上皮细胞的外侧，而不是顶端或基底侧，这表明VHH1-CAR-T不能靶向正常小肠或结肠的原因之一可能是VHH1-CAR-T不能到达或结合肠上皮细胞紧密连接外侧的CDH17。相比之下，由于缺乏极性，肿瘤细胞在其细胞表面表达CDH17，这可能会增强肿瘤细胞对CAR-T介导的杀伤的敏感性。那么，如果肠道上皮的完整性被破坏，是否会有更多的T细胞渗入肠道呢？

随后，研究小组将mVHH1-CAR-T注射到野生型(WT)免疫活性小鼠体内，然后将它们分成两组。一组小鼠喝纯净水，另一组小鼠喝含有DSS(葡聚糖硫酸钠，一种常见的诱导药物)的水；结果表明DSS处理缩短了结肠长度，组织学研究表明DSS处理会破坏肠上皮的完整性。定量分析显示，注射CAR-T的小鼠的DSS治疗显著增加了CD3 T细胞向受损肠上皮的浸润。

虽然这项研究本身不能直接证明紧密连接阻止CAR-T，但它与肠上皮完整性或紧密连接对阻止CAR-T穿透至关重要的观点一致。

上述结果表明，VHH1-CAR-T可以根除表达CDH17的NT-3肿瘤，同时保留也表达CDH17的健康小肠和结肠，表明CDH17是开发用于GIC和NET的CAR-T疗法的安全有效的靶标。

肠上皮损伤后，T细胞渗入结肠。

肿瘤特异性抗原的缺乏是限制CAR-T在实体肿瘤治疗中发展的主要挑战之一(包括GIC和NETs)，因此有必要确定一种安全且可靶向的TAA。

总的来说，本研究表明CDH17是GIC和NET嵌合抗原受体T细胞治疗的理想靶点。CDH17在GIC和NET中表达上调；VH-CAR-TS (CDH17 CAR-TS)可以根除表达CDH17的肿瘤，包括胰网、GC、PC和CRC；CDH17阳性肿瘤可在各种异种移植或原位肿瘤模型中被根除。

最后，CDH17CAR-T在不影响小鼠体重和肠道组织学变化的情况下根除了肿瘤，大量CAR-T浸润到肿瘤组织中，但在小鼠的健康组织中没有发现这种浸润，包括表达CDH17的小肠和结肠。总之，本研究表明CDH17是NET和其他CDH17阳性实体瘤过继免疫治疗的潜在靶点。

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