《自然·遗传学》:从息肉到肠癌 发生了什么？首次从单细胞水平揭示了肠癌癌前转化的特征

大肠癌的发生发展遵循一个明确的规律，即从肠息肉到腺瘤，最后到腺癌。

据统计，80%的CRC存在APC缺失或功能缺失突变。在肿瘤发生的早期，APC突变会导致WNT通路的上调和肠上皮细胞的增殖。随后，其他癌症驱动基因的激活(如KRAS突变)或肿瘤抑制基因的失活(如TP53突变)将进一步促进肿瘤的恶性转化[1]。

目前大部分CRC的研究集中在对晚期肿瘤的分析，分析的准确性仅限于肿瘤的整体水平，忽略了肿瘤的早期发展和肿瘤的微环境。因此，肠上皮细胞癌变过程以及组织微环境中其他成分在此过程中的作用是结直肠癌领域亟待解决的问题。

最近，由斯坦福大学医学院的迈克尔p斯奈德(Michael P. Snyder)和威利安j格林利夫(Michael j . green leaf)领导的研究小组在期刊《自然 遗传学》上发表了关于结直肠癌发生的重要研究成果[2]。

研究小组收集了27份正常肠道组织、48份肠息肉和6份结直肠癌样本。利用这些组织，研究人员在单细胞水平上建立了正常肠道组织中CRC转化过程中的染色质可及性和转录组图谱。

他们不仅在肠息肉和CRC组织中发现了一组新的具有干细胞表型的上皮细胞，而且在高级别息肉中发现了丰富的干细胞样上皮细胞，肿瘤微环境中的调节性T细胞(Tregs)和癌前相关成纤维细胞(preCAFs)也有所增加。

本研究首次在单细胞水平上描述了大肠癌癌前转化的特征，分析了导致这些特征的分子机制，填补了大肠癌癌前转化研究的空白，为癌前病变的分期和癌症风险的预测提供了详细的参考。

因为APC突变在结直肠癌中非常常见，并且对结直肠癌的早期发生至关重要，所以研究小组决定使用APC种系突变导致的家族性腺瘤性息肉病(FAP)作为研究模型。FAP患者的特征在于在其结肠中形成超过100个具有不同阶段和分子差异的腺瘤性息肉，并且这些息肉中的大多数将发展成CRC。

为了更全面地了解结直肠癌的发生发展，研究人员收集了健康人的结肠组织、FAP和非FAP患者的肠息肉和结直肠癌组织。研究人员使用单细胞核转录组测序(snRNA-seq)和单细胞染色质转座酶可及性测序(scATAC-seq)来分析和比较不同阶段组织的转录组和表观遗传组之间的差异。

起初，研究人员简单地将组织中的细胞分为上皮细胞、免疫细胞和基质细胞。在聚集分析中，不同组织的免疫细胞和基质细胞表现出明显的聚集。然而，上皮细胞分散分布，形成正常组织、息肉和CRC亚群。因此，研究人员将不同组织中的免疫细胞和基质细胞作为一个整体进行分析，而将来自不同组织的上皮细胞分别进行分析。

随后，研究人员参考已知标记基因的表达状态注释了snRNA-seq数据，用标记基因的染色体活性值(基因区域中的染色体可及性)注释了scATAC-seq数据。

基于scATAC-seq数据，研究人员发现了一组CRC特有的衰竭T细胞。在这组细胞中，T细胞耗竭的标志基因区具有较高的染色体活性值，同时T细胞耗竭的特异DNA基序区(如NR4A、RUNX、CEFB、JUN、FOS和BATF)也具有较高的染色体可及性。

此外，snRNA-seq和scATAC-seq均显示，与正常组织相比，调节性t细胞(treg)在息肉和CRC中富集，并且这些treg在从息肉到CRC的转变中持续增加，这表明这些treg可能参与了癌前转化的免疫逃逸。与这些Tregs相反，息肉和结直肠癌中的初始B细胞、记忆B细胞和生发中心细胞的数量与正常组织相比减少。

在对基质细胞亚群的分析中，研究人员发现，在正常组织向癌变组织的转化过程中，成纤维细胞亚群也发生了很大的变化。

首先，研究人员发现了一组CRC特有的癌症相关成纤维细胞(caf)，这些caf的染色质可及性受到转录因子RUNX1的特异性调节。

其次，通过对scATAC-seq数据的聚集分析，研究人员发现了另一组在息肉和CRC中都富集的成纤维细胞。这些细胞的染色质可及性与CAFs有些相似(例如WNT2基因区)，因此研究人员将这组成纤维细胞定义为癌前相关成纤维细胞(preCAFs)。研究人员得出结论，这些癌前病变可能具有与癌前病变相似的功能，并可能促进癌前病变的恶性转化。

研究人员还在息肉和癌症组织中观察到许多具有干细胞特征的上皮细胞，这些干细胞样细胞的丰度随着恶性转化而增加。

基于snRNA-seq和scATAC-seq建立的细胞状态转换轨迹，研究人员发现，在正常组织中

息肉 CRC的恶性转化中，干细胞样上皮细胞的基因表达和染色体可及性都呈递进式变化。与之相反，分化成熟的肠细胞在恶性转化中则减少，其中杯状细胞的减少尤为明显。

因此，研究人员推断这群具有干细胞特性的细胞可能代表了癌症干细胞，而杯状细胞的缺失或许也会促进肿瘤发生。

除此之外，研究人员通过表观遗传组学分析还发现，在正常组织 息肉 癌组织的转化中，染色体发生有序的打开和关闭，同时癌症相关基因也发生有序的上调或下调。在不同的阶段，调控元件和转录因子的活性和特异性也有所不同。

在转化早期，具有转录因子TCF和LEF结合基序的染色质区域的可及性上调，由此可以推断WNT通路也逐渐上调。与此同时，调控肠干细胞命运的主要基因ASCL2的基序结合区域的染色体可及性，在息肉和CRC中也呈现上调趋势。这与研究人员观察到的干细胞样细胞群体的扩大相符。

具有转录因子HNF4A结合基序的染色质区域的可及性则表现出更高的波动性，这一区域的活性在转化早期降低，而在恶性转化阶段升高。研究人员由此推断HNF4A在息肉和CRC中可能有不同的功能。在息肉中，HNF4A活性的降低或许使WNT通路得以被激活，而在CRC中，HNF4A可能通过驱动染色质可及性变化来调控癌症特异基因的表达。

最后，研究人员还观察到，息肉中的染色质可及性程度和CRC中的DNA甲基化程度呈高度负相关。DNA甲基化异常是导致CRC发生的一个重要因素。因此，研究人员建议，可以利用该负相关性检测癌前病变，来找出具有恶化潜质的息肉组织并进行移除，进而达到预防结直肠癌的发生的目的。

总的来说，这个研究在单细胞层面揭示了在CRC恶性转化过程中染色质可及性，基因表达，DNA甲基化以及组织中细胞组分的变化。

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