研究人员在大肠杆菌中实现了多种氧化贝壳杉烯二萜的高效从头合成

来源：分子植物卓越中心2022-08-29 09:17

目前，对映体-贝壳杉烯母核的氧化修饰主要通过化学合成实现，存在反应步骤冗长、产率低等诸多问题。此外，有机合成也很难实现具有立体选择性或位点特异性的高效氧化修饰。

近日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心研究员王勇在线发表了题为《在大肠杆菌中从头生产多用途氧化型贝壳杉烯二萜》的研究论文，以大肠杆菌为底盘，高效实现了11种不同氧化形式的对映体-贝壳杉烯二萜的从头生物合成。

对映贝壳杉烯二萜是一类具有多种化学结构的重要天然产物，在植物生长发育、微生物防御、非生物胁迫应答等生命过程中发挥着关键作用。此外，这些化合物还具有细胞毒性、抗肿瘤活性、特殊风味和口感等显著的理化性质，因此被广泛应用于食品工业和药物开发。在这些化合物的生物合成中，母核骨架的羟基化修饰为进一步的糖基化和酰化提供了支点，是最终产物多样性的重要前提。通常，对映贝壳杉烯母核的C1、C3、C7、C13、C16、C19等位置富含各种氧化修饰。例如，C7和C19的羧基化是赤霉素合成的关键步骤，C7、C3和C1的氧化取代在唇形科香茶菜属植物的活性二萜中尤为常见。C13羟基的引入对甜菊糖苷的合成非常重要，而以C16-羟基对映体-贝壳杉烯为前体的化合物包括雷公藤红素等具有抗HIV活性的分子。

目前，对映体-贝壳杉烯母核的氧化修饰主要通过化学合成实现，存在反应步骤冗长、产率低等诸多问题。此外，有机合成也很难实现具有立体选择性或位点特异性的高效氧化修饰。鉴于上述原因，本研究开发了一系列大肠杆菌工程菌株，实现了由特定细胞色素P450氧化酶和萜类合成酶介导的多种对映体-贝壳杉烯氧化中间体的从头合成。通过菌株筛选和前体增强，研究人员确定甲羟戊酸(MVA)途径增强的K菌株大肠杆菌是最合适的合成宿主。此外，通过从不同物种中筛选贝壳杉烯氧化酶(KO)并融合N-末端融合标记，成功提高了关键中间体对映贝壳杉烯(KA)的产量(~250 mg/L)。研究人员以甜菊醇(SV)为靶点，结合N端修饰、密码子优化、拷贝数和表达强度调控等多种策略，优化了贝壳杉烯类羟化酶(KA13H)13位。选择来自拟南芥的AtCYP714A2作为最佳KA13H，并借助引入细胞色素b5(来自甜茶的RsCYB5)提高电子传递和抑制蛋白质降解，SV大幅提高。为了进一步提高KA到SV的羟基化转化率，研究人员通过AlphaFold预测了AtCYP714A2的结构，并模拟了其与二萜底物的分子对接。根据蛋白质-底物复合物的对接模型，对底物结合口袋中的十余个关键氨基酸残基进行定点突变后，发现突变体I403L可以通过解除底物抑制、增强底物结合亲和力来提高KA在13位的羟基化效率。与野生型atcp714a 2相比，突变型I403L的KA转化率从71%提高到87%。在结合了最佳的KO和KA13H突变体后，研究人员在5L发酵罐中实现了克级甜菊醇的从头生物合成，产量达到了1.07g/L

在此基础上，将上述优化策略应用于不同的氧化修饰酶后，研究人员还成功获得了C3、C7、C16和C19的多种单或双氧化对映体-贝壳杉烯二萜。利用水稻OsCYP76M家族氧化酶、OsCYP99A3、链霉菌双加氧酶PtmO6、小裸子植物双功能萜类合酶PpCPS/KS和不同来源KO的组合生物合成策略，研究人员在大肠杆菌中合成了7-羟基-贝壳杉烯、3-羟基-贝壳杉烯、7-羟基-贝壳杉烯-19-酸、3-羟基-贝壳杉烯-19-酸、16 -羟基-贝壳杉烯和16 -19-二羟基-贝壳杉烯。

本研究建立了高效合成氧化型对映体-贝壳杉烯二萜的原核合成体系。从简单的碳源(甘油)出发，在不添加复杂前体的情况下从头合成了多种贝壳杉烯二萜氧化中间体，不仅为进一步工业化大规模制造复杂二萜奠定了基础，也为筛选和鉴定未知的贝壳杉烯二萜氧化酶提供了可靠的平台。

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