Science Advances:开发基于碱基编辑的全基因组微扰文库构建和筛选技术 |
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来源:天津工业卫生研究所2022-09-09 11:49
以重要的工业生产菌株谷氨酸棒杆菌为例,研究人员设计了约12000条sgRNA,构建了全基因组失活文库,覆盖率达98.1%。
通过全基因组微扰文库的构建和筛选,在宏观基因组水平上系统研究基因型与表型的对应关系,是微生物功能基因组学的重要方法。与单个基因微扰文库的构建和筛选相比,混合文库的构建和筛选可以通过一次实验实现特定条件下数千个基因的同时筛选,显著提高了通量。近年来,CRISPR/Cas技术以其简单、高效、可编程和易于追踪等优点,逐渐应用于全基因组杂交文库的构建和筛选。但由于DSB的毒性,基于DNA双链断裂(DSB)的CRISPR/Cas基因编辑方法需要添加外源DNA模板,并要求较高的同源重组效率,在微生物基因组文库的构建中有一定的局限性,尤其是在同源重组效率普遍较低的原核生物中。而基于CRISPR干扰的文库构建技术(CRISPR RI)受干扰效率影响较大,作用于多顺反子操纵子时难以定位目的基因。
中科院天津工业生物技术研究所研究员王萌带领高通量编辑筛选平台实验室,与生物设计中心平台实验室合作。结合胞嘧啶碱基编辑技术和针对全基因组的sgRNA混合文库,通过预先在基因编码区引入终止密码子,建立了全基因组单基因失活文库的构建方法,并用于功能基因的筛选。该方法不产生DSB,不需要添加外源DNA模板,不依赖于宿主的同源重组效率,操作简单,宿主通用性强,易于推广。
以重要的工业生产菌株谷氨酸棒杆菌为例,研究人员设计了约12000条sgRNA,构建了全基因组失活文库,覆盖率达98.1%。他们的文库在不同的筛选压力下进行筛选分析。与已报道的哺乳动物细胞和酵母中的数据处理方法不同,研究人员建立了一套新的sgRNA分析流程。通过对有无筛选压力样本的二代测序分析,可以根据sgRNA丰度的变化发现与筛选性状相关的功能基因。利用上述策略,成功筛选出与5-氟尿嘧啶、5-氟乳清酸抗性、氧化应激耐受性和糠醛耐受性相关的基因。首次发现溥儒和serA基因与糠醛耐受性相关。此外,研究人员开发了FSS GNA-Analyzer云平台,可以加速基于CRISPR/Cas技术筛选的数据处理和分析。本研究建立了基因组文库的通用杂交筛选策略,可加快谷氨酸棒杆菌的基础和应用研究,并为其他原核生物提供技术参考。
相关结果在科学进展发表。本研究得到了国家重点科技攻关项目的资助。d计划、国家、天津合成生物学创新能力促进行动、中科院青年创新促进会等。
基于碱基编辑技术的谷氨酸棒杆菌基因失活文库的构建和筛选
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