PNAS:单细胞拉曼结合靶向宏基因组揭示土壤活性抗生素抗性组

抗药性(AMR)在人类、环境、动物和植物中的传播加重了同一健康的全球负担。土壤是同一健康的关键环节之一，土壤携带的抗生素耐药性可通过食物链等途径传递给人类，从而构成健康威胁。土壤是地球上最丰富和最多样的微生物的家园，其中活性耐药细菌在推动耐药性在土壤中传播方面起着关键作用。然而，由于高达99%的土壤微生物无法培养，对土壤中活性耐药细菌的探索很少，土壤中抗生素耐药性风险的研究面临挑战，这阻碍了AMR环境行为和控制策略的发展。

虽然分子生物学技术提高了我们对土壤微生物群和抗性类群的认识，但基因信息只反映耐药潜力而非耐药表型，无法区分胞外、死亡或休眠细菌的DNA。因此，很难分析起作用的特定耐药微生物，这影响了对AMR健康风险的准确评估。基于培养的方法只能关注少数可培养的指示细菌，而忽略了土壤中大量未培养细菌的贡献。因此，迫切需要发展合适的技术手段，从表型和基因型两个方面全面分析土壤中重要的活性耐药菌。

中国科学院院士、中国科学院城市环境研究所研究员朱永冠在《美国国家科学院院刊》 (PNAS)发表了一篇论文，题目是《单细胞同位素探测和靶向基因组学在未探测土壤中的主动抗微生物体》。本研究通过发展单细胞拉曼稳定同位素标记和靶向宏基因组技术，对土壤中的原位活性抗生素抗性细菌进行了追踪，并对其表型抗性水平进行了量化。结合单细胞靶向分选和测序，揭示了土壤中高活性耐药菌的耐药群和移动群。朱永冠团队长期致力于环境耐药性的研究，提出了在同一健康背景下监测和防范抗生素耐药风险的理论框架。

本研究采用单细胞拉曼-重水同位素标记技术，针对土壤的复杂性及其对抗生素有效性的影响。通过优化抗生素用量、孵育时间和光谱深度，建立了准确示踪土壤中活性耐药菌的单细胞方法和判别标准。利用土壤原位环境中的多种已知耐药菌和敏感菌，相互验证了该方法在不同土壤和抗生素不同作用机制中的普适性和准确性，将该方法从简单的临床耐药菌研究拓展到含有大量未培养菌的复杂土壤环境。

利用该方法，可以克服单细胞水平和表型水平的培养限制，直接示踪和量化土壤中活性耐药菌的丰度和活性水平，揭示人类活动(如农业种植和污染排放)显著增加土壤的表型耐药水平。由于高代谢活性耐药菌在AMR环境传播中的重要作用，研究进一步提出将表型耐药水平作为环境AMR风险评估的新指标，改善了长期以来AMR风险评估只有基因信息而没有耐药表型信息的局面。

本研究旨在通过拉曼技术鉴定具有潜在健康风险的高活性土壤耐药细菌，利用单细胞分选和靶向宏基因组测序技术，大部分高表型耐药细菌被鉴定为以前难以研究的未培养细菌和一种新的耐药病原菌，证明土壤未培养细菌是AMR的重要宿主。研究团队在单细胞水平上破译了活性耐药菌携带的耐药基因、毒力因子和可移动遗传元件(包括质粒、插入片段和前噬菌体)。这项工作将多种抗生素耐药表型与多种基因型联系起来，为分析大量耐药表型提供了一种新方法

本工作开发的单细胞拉曼结合靶向宏基因组的方法为复杂环境下的耐药性研究提供了新的手段，加深了科学家对土壤中活性抗生素耐药性的认识。该方法可广泛应用于其他生态系统，对促进同一健康框架下的环境抗药性风险评估和制定防控策略具有重要价值。该研究得到了国家杰出青年科学基金项目、创新研究群体项目、面上项目、中科院基础前沿科学研究计划0到1原始创新项目的支持。

单细胞拉曼技术评价土壤中的表型耐药性及高活性耐药菌的靶向分选和测序