北京协和医院冷泠团队发文：基于皮肤类器官的感染平台鉴定出手足口病特异性抑制剂

1. hiPSC-SO易受EV-A71感染

采用改进的逐步分化方法，将hiPSC分化为包含表皮细胞、毛囊细胞和神经细胞的皮肤类器官。通过免疫荧光染色分析，确认了类器官中基底干细胞标记物、毛囊干细胞标记物以及泛神经元标记物的表达。电子显微镜观察进一步揭示了毛囊的不同层级结构、分泌的黑素体、细胞外基质和表皮中的桥粒等细节，证实了hiPSC-SO的结构完整性。

为了研究EV-A71感染对hiPSC-SO的影响，将类器官暴露于EV-A71病毒中，并在感染后不同时间点（2、4和8天）进行蛋白质组学分析。结果显示，随着感染时间的延长，hiPSC-SO中的病毒复制量逐渐增加，表明该类器官模型对EV-A71感染具有易感性。

通过全组织免疫染色和组织切片免疫染色分析，研究发现EV-A71病毒蛋白在毛囊细胞和神经细胞中均有表达，这表明EV-A71病毒能够感染这些细胞类型。此外，蛋白质组学分析共鉴定出3128、3198、3124和3053种蛋白质，分别对应感染后0、2、4和8天的hiPSC-SO，结果显示感染组与未感染对照组的蛋白质表达模式存在显著差异。

通过对比EV-A71感染的hiPSC-SO与未感染对照组的蛋白质表达，研究人员发现大量差异表达蛋白。上调蛋白主要富集在mRNA处理、翻译起始、病毒进入宿主细胞和DNA复制等过程，表明病毒复制相关过程在感染的hiPSC-SO中被激活。而下调蛋白则主要富集在胶原纤维组织、基底膜组织、角化和成纤维细胞增殖等过程，提示皮肤细胞和细胞外基质相关蛋白在EV-A71感染的hiPSC-SO中表达显著降低（图1）。

图1 hiPSC-SO易受EV-A71感染

2. EV-A71感染的hiPSC-SO的时间依赖性分子特征

为了深入研究EV-A71感染过程中hiPSC-SO的动态变化，在感染后2天、4天和8天分别进行了蛋白质组学分析。通过分析不同时间点的蛋白质表达谱，揭示了EV-A71感染的动态分子特征。在感染的早期阶段（2天），蛋白质组学分析显示，与病毒过程相关的蛋白质（如病毒基因组复制、DNA复制）表达显著上调。这些蛋白质的高表达表明，宿主细胞在感染初期主要协助病毒复制。

在感染中期（4天），与糖酵解过程和葡萄糖跨膜转运相关的蛋白质表达增加。这表明在感染中期，细胞的能量代谢显著增强，可能为病毒复制提供大量能量。在感染晚期（8天），与免疫反应相关的蛋白质和对细胞因子反应相关的蛋白质表达上调。此外，与缺氧反应相关的蛋白质也显著增加。这些结果表明，在感染晚期，宿主细胞的免疫反应和缺氧反应被激活，可能与病毒引起的炎症和组织损伤有关。以上数据显示了EV-A71与hiPSC-SO动态相互作用的过程，并表明病毒感染可导致皮肤特定生理结构和功能的紊乱（图2）。

图2 在EV-A71感染的hiPSC-SO中鉴定出的蛋白质的定量表达谱和生物学特征

3. EV-A71感染耗尽网状成纤维细

为了研究EV-A71感染对hiPSC-SO的影响，通过scRNA-seq和蛋白质组学分析，揭示了EV-A71感染对网状成纤维细胞的显著影响。网状成纤维细胞是一种特殊的成纤维细胞亚群，负责合成胶原蛋白，维持皮肤的纤维网络结构，为皮肤提供结构支持。研究发现，在EV-A71感染后网状成纤维细胞的数量显著减少。这种减少不仅影响了皮肤的结构完整性，还可能引发免疫反应的失衡。通过分析差异表达基因发现，网状成纤维细胞和增殖性成纤维细胞在感染后均表现出与宿主-病毒相互作用、DNA修复、凋亡和衰老相关的蛋白质表达上调。特别是网状成纤维细胞中与病毒转录和对病毒反应相关的蛋白质表达更为显著，表明网状成纤维细胞是EV-A71感染的主要靶点。感染后网状成纤维细胞中与TNF- 和IL-1介导的信号通路相关的炎症因子表达上调。这些炎症因子的增加可能进一步激活基质金属蛋白酶（MMP），导致细胞外基质成分的大量降解，从而加剧皮肤的损伤和衰老（图3）。

图3 EV-A71感染会耗尽网状成纤维细胞

4. EV-A71感染通过Hippo-YAP/TAZ信号通路促进祖细胞增殖

为了进一步研究EV-A71对表皮细胞的影响，分析了表皮细胞亚型的scRNA-seq数据，这些亚型包括基底干细胞、成熟表皮细胞和NNMT+SFRP1+祖细胞。研究发现，在EV-A71感染后NNMT+SFRP1+祖细胞的数量翻倍，这一现象表明EV-A71感染可能通过某种机制促进了祖细胞的异常增殖。通过分析差异表达基因发现EV-A71感染后，与EGF/EGFR信号通路、TGF- 信号通路、整合素介导的细胞黏附、紧密连接以及Hippo信号通路相关的基因在NNMT+SFRP1+祖细胞中显著上调，其中Hippo-YAP/TAZ信号通路的激活被认为是促进祖细胞增殖的关键机制。

整合素是一类重要的细胞表面受体，参与细胞与细胞外基质的黏附和信号传导。在EV-A71感染的NNMT+SFRP1+祖细胞中，整合素相关基因的表达显著上调，这可能为Hippo-YAP/TAZ信号通路的激活提供了基础。YAP和TAZ是Hippo信号通路的关键效应因子，在细胞增殖、存活和迁移中发挥重要作用。研究发现，EV-A71感染后YAP、TAZ和TEAD1的表达显著增加，这表明Hippo-YAP/TAZ信号通路被激活，从而促进了NNMT+SFRP1+祖细胞的增殖（图4）

图4 EV-A71感染通过Hippo-YAP/TAZ信号通路促进NNMT+SFRP1+PC的增殖

5. 药物可阻断EV-A71复制

为了深入探讨EV-A71感染后NNMT+SFRP1+祖细胞增殖的原因并筛选候选抗病毒靶点，从EV-A71感染的hiPSC-SO和对照样本之间的scRNA-seq数据中鉴定NNMT+SFRP1+祖细胞中的差异表达基因。研究发现，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）在EV-A71感染的细胞中表达显著上调。HMGB1是一种与自噬和病毒复制相关的蛋白，其在多种细胞类型中均表现出与EV-A71感染相关的高表达水平。

为了验证HMGB1在病毒复制中的作用，利用siRNA技术对HMGB1进行了基因敲低实验。结果表明，敲低HMGB1可显著抑制EV-A71在细胞中的复制，这表明HMGB1是病毒复制的关键促进因子。基于HMGB1的关键作用，筛选了多种已知的HMGB1抑制剂，并选择了FDA批准的HMGB1抑制剂NSC167409进行进一步研究。NSC167409用于感染EV-A71的细胞系，结果显示NSC167409能够以剂量依赖的方式显著抑制EV-A71的复制。为了评估NSC167409在体内环境中的抗病毒效果，通过对携带hiPSC-SO的人源化小鼠模型中进行了实验。在小鼠接受EV-A71感染前，通过皮下注射给予NSC167409进行预防性治疗，结果显示NSC167409能显著减少感染小鼠皮肤类器官中EV-A71的复制，表明该药物在体内也具有良好的抗病毒效果（图5）。

图5 NSC167409阻断EV-A71在体内和体外的复制

6. EV-A71通过自噬途径介导hiPSC-SO中表皮细胞功能障碍

为了进一步研究HMGB1在EV-A71感染中的具体作用，分析了EV-A71感染前后不同细胞亚群中HMGB1的表达水平。研究表明，HMGB1在不同细胞亚群中的表达在EV-A71感染后显著升高，尤其在NNMT+SFRP1+祖细胞和增殖性成纤维细胞中表现最为突出。抑制HMGB1可以减少这些细胞的数量，表明HMGB1的高表达与这些细胞的增生密切相关。基因富集分析揭示，HIF-1和自噬相关的信号通路在EV-A71感染的表皮细胞中被激活，提示病毒复制可能通过HIF-1和自噬通路实现。同时，EV-A71感染还激活了与免疫反应相关的多个信号通路，如IL-6、IL-2、IL-17和TGF 通路，这可能会导致表皮细胞中的炎症反应。免疫染色结果显示，抑制HMGB1可以减轻病毒感染引起的炎症反应，降低IL-6、IL-8等炎症因子的表达。此外，EV-A71通过Hippo-YAP/TAZ信号通路促进NNMT+SFRP1+祖细胞的增殖，且自噬与YAP信号通路之间可能存在相互关系（图6）。

图6 EV-A71通过hiPSC-SO中的自噬途径介导表皮细胞功能障碍