Science：颠覆教科书——去甲肾上腺素原来不直接调控神经元!星形胶质细胞才是幕后操盘手

NE 的经典作用：降低突触效率的 指挥棒

首先，研究人员在成年小鼠的脑海马切片中，通过记录场兴奋性突触后电位 (field excitatory postsynaptic potentials, fEPSPs) 来衡量突触的连接强度。fEPSP的大小反映了突触后神经元群体的兴奋程度。实验中，研究人员先记录一段基线数据，然后持续施加NE（浓度20 M）。结果显示，NE的应用导致海马CA1区域的fEPSP斜率（反映突触强度）显著下降，下降幅度高达40%左右。这种效应具有浓度依赖性，且在施加NE后迅速发生（在几分钟内）。这与之前许多研究的发现一致，确认了NE能够降低突触强度。

为了进一步探究NE是影响突触前神经元释放神经递质的能力（突触前效应），还是影响突触后神经元接收信号的能力（突触后效应），研究人员测量了配对脉冲易化指数 (paired-pulse facilitation index, PPF)。PPF衡量的是两次间隔很近的刺激引起的突触后电位幅度之比，它与突触前神经递质释放概率呈负相关：释放概率越低，PPF越高。结果发现，当NE导致fEPSP斜率下降的同时，PPF显著升高，通常在NE应用后10分钟内达到基线值的140%。fEPSP下降的幅度和PPF升高的幅度之间存在很强的相关性（相关系数高达0.903），这强烈暗示NE的作用机制在于降低了突触前神经递质的释放概率。

为了更直接地验证这一结论，研究人员进行了最小刺激实验，通过全细胞膜片钳技术记录单个突触的兴奋性突触后电流 (excitatory postsynaptic currents, EPSCs)。在这种极低的刺激强度下，突触前神经元有时会释放神经递质（成功），有时则不释放（失败），通过计算失败率可以反映突触前释放概率。实验结果显示，施加20 M NE后，记录到的成功传递的EPSC幅度（反映突触后效能）没有显著变化，但突触前传递失败的比例显著增加（从基线的大约32%增加到NE作用后的64%），这直接证明了NE确实通过降低突触前神经元的神经递质释放概率来抑制突触强度。

最后，研究人员使用光遗传学 (optogenetics) 技术，特异性地刺激产生NE的蓝斑核神经元纤维，模拟内源性NE释放。他们在表达Cre重组酶的小鼠蓝斑核中注射携带光敏感通道蛋白（ChR2）的病毒，使LC神经元表达ChR2。12周后，在海马切片中用光刺激LC神经元纤维（使用450 nm的光，1 Hz频率，持续10分钟）。结果观察到，即使是如此低频的光刺激，也导致了fEPSP斜率的适度但持续下降，同时伴随PPF的等量升高。这与施加外源性NE的效果一致，表明内源性释放的NE也能通过降低突触前效能来抑制突触传递。

谁在接收 NE 的信号？不再是唯一的答案

既然确定了NE通过影响突触前释放来降低突触强度，那么NE是与哪个受体结合来实现的呢？传统观点认为肾上腺素能受体是关键。肾上腺素能受体主要分为 1、 2和 三个亚型。研究人员通过药物阻断实验发现，使用 1-AR拮抗剂prazosin（1 M）或特异性的 1A-AR拮抗剂silodosin（50 nM）可以完全阻断NE引起的fEPSP下降和PPF升高。而 2-AR拮抗剂yohimbine或 -AR拮抗剂propranolol，单独或联合使用，都不能阻断NE的作用。特异性的 1A-AR激动剂A61603（70 nM）则可以模仿NE的作用，导致fEPSP下降和PPF升高。这些药理学证据强有力地表明，在海马CA1区域，NE对突触功能的调控主要依赖于 1A-AR。

然而，这里出现了一个 反直觉 的矛盾。 1A-AR属于Gq偶联受体，其激活通常被认为会促进细胞内钙释放，在神经元中激活Gq通常会增强突触前钙内流，从而促进神经递质释放，导致突触易化而非抑制。事实上，研究人员通过化学遗传学方法特异性激活突触前神经元表达的Gq偶联受体hM3d(Gq)后，观察到的是突触前释放概率的增加，与NE的作用完全相反。

另外，NE对突触的抑制效应（IC50大约3.5 M）所需的浓度比NE与 1A-AR的结合亲和力（大约0.28 M）高出12倍，这也提示NE的作用可能不是简单地通过直接作用于突触前神经元上的 1A-AR来实现的。这些矛盾之处促使研究人员思考：NE是否通过一个比传统模型更复杂的机制来影响突触功能？

星形胶质细胞的秘密武器：钙信号的 开关 作用

考虑到星形胶质细胞也表达 1A-AR并对NE作出钙反应，并且它们能够调控突触功能，研究人员提出了一个大胆的假设：NE可能首先作用于星形胶质细胞的 1A-AR，诱发星形胶质细胞的钙信号，进而由星形胶质细胞释放某种信号分子来调节突触功能。

为了验证这个假设，研究人员首先确认了星形胶质细胞对NE的反应。他们使用双光子显微镜 (two-photon laser scanning microscopy, 2-PLSM) 记录了海马切片中星形胶质细胞的钙活动。在施加20 M NE后，观察到几乎所有视野内的星形胶质细胞都出现了细胞范围的钙升高，这种反应也是浓度依赖性的。重要的是，特异性 1A-AR拮抗剂silodosin能够显著抑制NE诱导的星形胶质细胞钙升高，证实了星形胶质细胞的钙反应确实由其上的 1A-AR介导。此外，silodosin本身也影响了星形胶质细胞的自发钙活动，并改变了突触的基线强度和PPF，这暗示星形胶质细胞的 1A-AR可能参与了对突触的持续性调控。

更关键的是，如果星形胶质细胞是NE调节突触的必经之路，那么阻断星形胶质细胞的钙信号就应该能阻断NE的作用。研究人员使用了多种方法来抑制星形胶质细胞的钙信号。首先，他们通过病毒载体在海马CA1区域的星形胶质细胞中特异性表达了i ARK，这是一种Gq偶联受体抑制剂，能够阻止Gq偶联受体激活下游的钙信号通路。荧光染色证实，i ARK在92%的海马星形胶质细胞中特异性表达。在这些表达i ARK的切片中，星形胶质细胞对NE的钙反应被显著抑制，只剩下大约25%的基线反应。随后进行fEPSP记录发现，NE在对照组切片中引起了预期的突触抑制和PPF升高，但在表达i ARK的星形胶质细胞切片中，NE对fEPSP斜率和PPF的作用被大大减弱，其抑制效应平均只剩下大约4.8%，相当于对照组效应的16%。尽管仍有残余效应，但考虑到i ARK未能完全阻断星形胶质细胞的钙反应，这个结果已经非常支持星形胶质细胞是NE作用所必需的。

为了排除单个方法的局限性，研究人员又使用了另外两种独立的抑制星形胶质细胞钙信号的方法：CalEx（促进钙外流）和thapsigargin（耗竭内质网钙库）。这两种方法在机制上完全不同，但都显著抑制了星形胶质细胞对NE的钙反应。结果也惊人地一致：无论使用CalEx还是thapsigargin，NE对突触的抑制作用都几乎消失了。这三种独立的实验方法都指向同一个结论：阻断星形胶质细胞的钙信号， 锁死 了它们对NE的响应，NE对突触的调控作用也随之失效。这有力地证明了星形胶质细胞的钙动力学在NE调控突触功能中扮演着 门控 （gating）的关键角色。

推翻传统：神经元自身的 NE 受体并非必需！

既然星形胶质细胞如此重要，那么传统观点中神经元自身的NE受体（ 1A-AR）是否仍然必需呢？这可能是整个研究中最 颠覆 的地方。研究人员决定通过基因敲除的方法，特异性地从神经元或星形胶质细胞中删除 1A-AR基因 (Adrala)。

首先，他们在 1A-AR基因两侧插入loxP位点的fl/fl小鼠海马CA3和CA1区域注射病毒，在神经元中特异性表达Cre重组酶（病毒为AAV5-hSyn::Cre-GFP）。hSyn启动子保证Cre主要在神经元中表达。免疫荧光染色证实，在CA3和CA1区域，88%和89%的NeuN阳性细胞（神经元）表达Cre-GFP。基因组DNA分析也显示，在病毒注射的海马区域，神经元内的Adrala基因发生了有效的Cre介导重组。

在这些神经元特异性Adrala敲除（N-AdralaKO）小鼠的脑切片中进行fEPSP记录发现，施加20 M NE后，突触强度仍然显著下降，PPF显著升高。无论是与注射对照病毒（仅表达GFP的Cre）的对照组小鼠切片相比，还是与其他对照条件相比，NE的作用幅度在神经元特异性Adrala敲除小鼠切片中都没有显著差异。换句话说，即使神经元失去了主要的NE受体 1A-AR，NE依然能够有效地抑制突触！为了确认神经元自身的 1A-AR确实丧失了功能，研究人员进行了全细胞膜片钳记录，发现NE在对照组神经元中引起明显的内向电流（这是 1A-AR激活导致钾通道抑制的结果），而这种电流在神经元特异性Adrala敲除小鼠的神经元中完全消失。这证明基因敲除是有效的，且神经元确实缺乏了功能性的 1A-AR。但尽管如此，NE的突触调控功能却丝毫不受影响。

接着，研究人员进行了互补的实验：在星形胶质细胞中特异性敲除Adrala基因（A-AdralaKO）。他们在Adralafl/fl小鼠海马CA1区域注射病毒，在星形胶质细胞中特异性表达Cre重组酶（病毒为AAV5-gfaABCID::Cre-GFP）。gfaABCID启动子确保Cre主要在星形胶质细胞中表达。免疫荧光染色证实，76%的星形胶质细胞表达Cre-GFP，且特异性非常高（99%）。星形胶质细胞的基因组DNA和mRNA分析都证实了Adrala基因在星形胶质细胞中被有效敲除。

在这些星形胶质细胞特异性Adrala敲除小鼠的脑切片中，星形胶质细胞对NE的钙反应完全消失了。而在这些切片中进行fEPSP记录发现，施加20 M NE后，对突触强度和PPF竟然完全没有影响！NE的作用彻底消失了。

这两个基因敲除实验结果形成了鲜明对比：神经元特异性删除 1A-AR，NE的作用保留；星形胶质细胞特异性删除 1A-AR，NE的作用消失。这有力地证明，NE并不直接作用于神经元上的 1A-AR来调控突触，而是必须通过星形胶质细胞上的 1A-AR来发挥作用。

星形胶质细胞的幕后信使：ATP 与腺苷的 接力棒

既然NE通过星形胶质细胞起效，那么星形胶质细胞接收到NE信号并产生钙升高后，又是通过什么分子来影响突触的呢？文献中已知，星形胶质细胞的钙升高可以触发多种分子的释放，包括ATP和D-丝氨酸等。在海马区，ATP可以快速被细胞外酶水解成腺苷 (adenosine)，而腺苷是调控突触功能的关键分子。腺苷主要作用于腺苷A1受体 (A1 receptors, A1Rs)，A1Rs是G₁偶联受体，其激活通常会抑制神经递质释放，主要分布在突触前末端。

研究人员猜测，星形胶质细胞可能是通过释放ATP，ATP再转化为腺苷，腺苷作用于突触前的A1R来介导NE的作用。他们首先直接在海马切片中施加腺苷，发现腺苷也能引起fEPSP的下降和PPF的升高，其效果与NE非常相似，且通过最小刺激实验证实是突触前效应。接着，他们使用特异性的A1R拮抗剂CPT或DPCPX，发现它们能够完全阻断NE引起的突触抑制。这表明A1R是NE作用的必需下游靶点。而阻断其他类型的腺苷受体或代谢型谷氨酸受体则没有效果。

为了确认腺苷是否是那个从星形胶质细胞释放出来并起效的 信使 ，研究人员采取了多种方法。首先，他们在腺苷A1R基因 (Adora1) 两侧插入loxP位点的fl/fl小鼠中，特异性地在海马CA3区域（突触前神经元富集）表达Cre重组酶，以敲除突触前神经元上的A1R（CA3-Ado1KD）。发现在这些小鼠切片中，NE对突触的抑制效应被部分削弱（削弱了59%），可能是因为病毒注射未能覆盖所有CA3神经元导致敲除不完全。通过增加注射次数，实现更广泛的突触前A1R敲除后，NE的作用完全消失了。而在CA1区域（突触后神经元富集）敲除A1R则不影响NE的作用。这与A1R主要在突触前发挥抑制作用的已知功能一致，并再次确认NE的作用依赖于突触前的A1R。

接着，研究人员使用了腺苷脱氨酶 (adenosine deaminase, ADA)，这是一种能够水解细胞外腺苷的酶。将ADA添加到海马切片中，会迅速清除细胞外的腺苷。结果发现，在ADA存在的情况下，NE对突触的功能完全失去了作用。这直接证明，腺苷是NE调控突触功能的必需 效应分子 ，NE必须通过某种机制增加细胞外腺苷才能起效。

最后，研究人员检查了ATP转化为腺苷的途径。细胞外的ATP主要通过胞外核苷酸酶CD39和CD73 (NT5e) 逐步水解产生腺苷。他们在CD73敲除 (NT5eKO) 小鼠中检查NE的作用。NT5eKO小鼠的海马切片中缺乏生成腺苷的最后一步酶。结果发现，在NT5eKO小鼠切片中，NE对突触强度和PPF完全没有影响。然而，直接施加腺苷在NT5eKO小鼠切片中仍然能够引起正常的突触抑制和PPF升高，这表明NT5eKO小鼠的A1R功能正常，仅仅是无法有效生成腺苷。

综合这些实验结果，一个清晰的信号通路浮现出来：NE首先作用于星形胶质细胞上的 1A-AR，引发星形胶质细胞内的钙升高，进而导致ATP释放到细胞外，ATP被胞外酶（尤其是CD73）水解为腺苷，腺苷作用于突触前神经元上的A1R，抑制突触前神经递质释放，从而降低突触强度。星形胶质细胞是这个复杂通路中的关键 中转站 和 放大器 。

结论：重塑大脑连接的 星形 力量

这项研究的发现，以前所未有的清晰证据，彻底挑战了长期以来关于NE如何调控突触功能的传统观念。它揭示了一个出乎意料的复杂机制：NE并没有直接 跳过 星形胶质细胞去影响神经元，而是将星形胶质细胞作为 中介 ，通过激活星形胶质细胞的 1A-AR并引起钙信号，驱动星形胶质细胞释放ATP并转化为腺苷，腺苷再作用于突触前的A1R，最终抑制突触传递。神经元自身的NE受体（ 1A-AR）在这个特定的突触调控过程中竟然是非必需的。

这个新的模型强调了星形胶质细胞在大脑功能调控中的核心作用，特别是在神经调质系统中的参与。NE这样的容量性神经调质（volume-transmitted neuromodulator）并不仅仅地作用于突触上的特定受体，它会弥散到细胞外空间，而星形胶质细胞的进程遍布整个突触微环境和细胞外空间。它们能够整合来自神经元和其他胶质细胞的信号，并根据自身状态（由NE等神经调质调控）释放多种信号分子，精确地调控局部突触甚至更广泛的神经回路的功能。这项工作描绘了星形胶质细胞如何作为NE和突触之间的桥梁，将宏观的神经调质信号转化为微观的突触效能变化。

这项研究不仅仅局限于NE。许多其他的神经调质，比如乙酰胆碱 (acetylcholine) 和催产素 (oxytocin)，也已被发现能够激活星形胶质细胞并引起钙升高。这项研究揭示的 神经调质- 星形胶质细胞- 钙信号- 释放信号分子- 作用于突触 这一基本模式，很可能是一种更普遍的神经调质调控突触和大脑功能的方式。它促使我们重新思考其他神经调质的作用机制，从一个更全面的视角理解大脑中神经元与胶质细胞之间精妙而动态的相互作用。

总而言之，这项研究打开了理解大脑状态转换和行为适应的新视角，揭示了星形胶质细胞并非被动的支持者，而是主动参与神经回路重塑的关键玩家。去甲肾上腺素的 指挥棒 ，原来是通过星形胶质细胞这支 交响乐队 的协调，才奏响了改变大脑连接的乐章。大脑功能的复杂性，远超我们过去的想象！

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