全文编译!复旦大学张永振课题组发表Nature论文揭示新型冠状病毒2019

通过与β冠状病毒属的两个代表性成员---人类起源的冠状病毒（SARS-CoV Tor2，AY274119）和蝙蝠起源的冠状病毒（Bat-SL-CoVZC45，MG772933）---进行序列比对，对WHCV的病毒基因组结构特征进行了描述。基于这种序列比对和开放阅读框（ORF），对WHCV的非翻译区（UTR）和ORF进行了定位。WHCV病毒基因组类似于这两种冠状病毒（图1），它的基因次序为：5"-replicase ORF1ab-S-envelope(E)-membrane(M)-N-3"。WHCV具有典型的β冠状病毒的5"和3"末端序列，5"末端有265 nt，3"末端有229 nt。这个预测的WHCV ORF1ab基因（编码复制酶）长度为21291 nt，包含16个预测的非结构蛋白（NSP），随后是（至少）13个下游ORF。此外，WHCV在nsp1中与SARS-CoV具有一个高度保守的结构域（LLRKNGNKG：氨基酸122-130）。WHCV的S、ORF3a、E、M和N基因的预测长度分别为3822 nt、828 nt、228 nt、669 nt和1260 nt。除了Sarbecovirus亚属的所有成员都具有这些ORF区域之外，WHCV与SARS-CoV相似，是因为它携带一个预测的位于M基因（编码包膜蛋白的ORF）和N基因之间的ORF8基因（长度为366 nt）。WHCV ORF的功能是根据已知的冠状病毒预测的。与SARS CoV Tor2类似的是，一个前导转录调控序列（TRS）和9个假定的TRS可以很容易地在WHCV ORF的5’端上游鉴定出来，其中假定的保守性TRS核心序列以两种形式---ACGAAC和CUAAAC---之一出现。

为了确定WHCV与先前鉴定的冠状病毒之间的进化关系，这些研究人员基于整个基因组序列的核苷酸序列、非结构蛋白基因ORF1a和ORF1b以及S、E、M和S编码的主要结构蛋白，估算了系统进化树。 N个基因（图2和扩展数据图5）。在所有系统进化树中，WHCV与Sarbecovirus亚属的成员（包括导致2002-2003年全球SARS 疫情的SARS-CoV）以及从蝙蝠中采集的许多SARS样冠状病毒簇集在一起。然而，根据所使用的基因不同，WHCV在Sarbecovirus亚属内的拓扑位置发生变化，这提示着这组病毒在过去发生了重组事件（图2）。具体而言，在S基因系统进化树中，WHCV与蝙蝠冠状病毒bat-SL-CoVZC45存在最为密切的亲缘关系，氨基酸一致性为82.3％，而与SARS-CoV的氨基酸一致性大约为77.2％）；在ORF1b系统进化树中，WHCV下降至Sarbecovirus亚属内的基础位置（图2）。这种拓扑划分（topological division）可能反映了蝙蝠病毒Sarbecovirus之间发生的重组事件，也在利用复制酶多蛋白pp1ab的保守结构域估算的系统进化树中观察到。

为了更好地了解WHCV感染人类的潜力，将它的刺突蛋白（S）的受体结合结构域（RBD）与SARS-CoV和蝙蝠SARS样冠状病毒中的RBD进行了比较。WHCV的RBD序列与SARS-CoV的RBD序列（氨基酸一致性为73.8％～74.9％）和包括毒株RB4874、Rs7327和Rs4231在内的能够利用人ACE2受体进入细胞的SARS样冠状病毒（氨基酸一致性为75.9％～76.9％）存在更为密切的亲缘关系。此外，WHCV RBD仅比SARS-CoV RBD长一个氨基酸。相反，与SARS-CoV相比，包括毒株Rp3在内的不能使用人ACE211的其他蝙蝠SARS样冠状病毒在473-477和460-472位点发生氨基酸缺失。先前确定的与人ACE2（PDB 2AJF）结合在一起的SARS-CoV RBD的晶体结构显示，区域473-477和460-472与人ACE2直接相互作用，因此可能在确定物种特异性中起着重要的作用。

这些研究人员使用SWISS-MODEL服务器进行蛋白同源性建模预测了WHCV、Rs4874和Rp3 RBD结构域的三维蛋白质结构，并将它们与SARS-CoV RBD结构域的晶体结构（PDB 2GHV）进行了比较。与序列比对相一致的是，WHCV和Rs4874 RBD结构域的预测蛋白结构与SARS-CoV的RBD结构域存在密切的亲缘关系，并且与Rp3 RBD结构域的预测蛋白结构不同。此外，相比于可以结合唾液酸的其他人类冠状病毒（HKU1和OC43），WHCV S蛋白的N末端与SARS-CoV S蛋白的N末端更相似。总之，WHCV和SARS-CoV RBD结构域在氨基酸序列和预测的蛋白结构方面存在高度相似性表明WHCV可能有效地利用人ACE2作为细胞进入受体，从而潜在地促进人与人之间的传播。

为了进一步表征Sarbecovirus病毒的进化史中发生的推定重组事件，这些研究人员使用了重组检测程序v4（Recombination Detection Program v4, RDP4）分析了WHCV和四种代表性冠状病毒---蝙蝠SARS样冠状病毒 Rp3，CoVZC45，CoVZXC21和SARS-CoV Tor2---的全基因组序列。尽管相似性图提示着WHCV和SARS-CoV或SARS样冠状病毒之间可能发生重组事件，但没有明显的证据表明整个基因组都发生重组。然而，在WHCV和SARS-CoV和蝙蝠SARS样冠状病毒（WIV1和RsSHC014）的S基因中检测到一些在过去发生重组事件的证据（p 3.147×10-3 to p 9.198×10-9），而且相似性图提示着在将WHCV S基因分为三个区域的核苷酸1029和1652处存在重组断裂点（图3）。在片段（nt 1～1029）和片段（nt 1652至S基因序列末端）的系统进化树中，WHCV与蝙蝠冠状病毒Bat-SL-CoVZC45和Bat-SL-CoVZXC21存在最为密切的亲缘关系，而在片段（nt 1030～1651）的系统进化树中，WHCV与能够直接人际传播的SARS-CoV和蝙蝠SARS样冠状病毒（WIV1和RsSHC014）划分在一起。尽管这些重组事件似乎在Sarbecovirus病毒中比较常见，但没有证据表明重组促进了WHCV的出现。