华人科学家最新两篇Nature Biotechnology构建出构建更好的碱基编辑器

2020年2月12日讯/BIOON/---基于CRISPR的基因编辑具有潜在的治疗优势，但也存在一些技术缺陷。在这些基因编辑工具中，碱基编辑器可以重写组成DNA的四个碱基---腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）---之一。

如今，在两项新的研究中，来自美国布罗德研究所和霍华德休斯医学研究所的研究人员发明了新的CRISPR工具，这些工具通过改进碱基编辑器的精确度和基因组靶向能力解决了它们面临的一些挑战。相关研究结果于2020年2月10日在线发表在Nature Biotechnology期刊上的论文中，论文标题分别为“Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors”和“Continuous evolution of SpCas9 variants compatible with non-G PAMs”

图片来自Frontiers in Plant Science, 2018, doi:10.3389/fpls.2018.01361。 碱基编辑器的工作原理是靶向DNA的特定区域，然后将某些碱基转换为其他的碱基。在转换之后，碱基编辑器，比如将C G转化为T A的胞嘧啶碱基编辑器，有时会执行不必要的脱靶编辑。到目前为止，即便是最好的CRISPR工具---来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9核酸酶（SpCas9），也仅能与DNA上16个位置中的大约一个结合，从而使得许多基因突变无法校正。

在第一项新的研究中，这些研究人员设计出新的胞嘧啶碱基编辑器，将一种难以捉摸的脱靶编辑减少了10～100倍，从而使得这些新的胞嘧啶碱基编辑器特别有望用于治疗人类疾病。在第二项新的研究中，他们通过让现有的Cas9蛋白进化而获得了新一代CRISPR-Cas9蛋白，它们能够靶向更大部分的致病突变，包括一种导致镰形细胞的突变。在此之前，这种突变仍然很难通过以前的CRISPR方法加以靶向。

这两篇论文的通讯作者、布罗德研究员默金医疗变革技术研究所所长、哈佛大学化学与化学生物学教授、霍华德休斯医学研究所研究员David Liu说，“鉴于人类基因组编辑时代尚处于脆弱的起步阶段，因此，当我们开始将这些基因编辑器导入人体时，我们应尽一切努力将任何不良影响的风险降至最低，这一点很重要。将这种难以捉摸的脱靶编辑--- Cas9非依赖性编辑（Cas9-independent edit，即不依赖于Cas9的编辑）---减到最少是实现这一目标的重要一步。这种脱靶编辑可以在基因组的随机位置上发生。当你进行10次实验时，你会得到10个不同的答案。这使得研究这一点极具挑战性。”

寻找脱靶编辑

一种检测Cas9非依赖性编辑的方法是对整个基因组进行多次测序。但是，这样的实验既耗时又昂贵，需要耗费数万美元。相反，Liu和他的团队设计了五种新的测试，可以快速低成本地检测到这些编辑，而无需全基因组测序。在一种测试中，他们递送了一种不同的CRISPR蛋白来保持DNA双螺旋链在人类基因组的六个不同位置打开。碱基编辑器强烈地偏好编辑单链DNA，因此开放的DNA链会吸引任何行为不端的碱基编辑器。Liu说，“通过让DNA链保持开放，这种测定方法诱导碱基编辑器进入并编辑开放的DNA，如果它有这样做的倾向的话。”

随后，Liu和他的团队搜索了6条开放的DNA链中发生的碱基编辑。他们对整个基因组进行了测序，以验证他们的测定结果是否与之前的更慢更昂贵但经过验证的方法（即前面提及的多次基因组测序）的结果相匹配，并且它们确实匹配。

接下来，Liu团队测试了所有主要类型的胞嘧啶碱基编辑器（总共14种），以确定哪种产生较少的脱靶编辑。

一种称为YE1的胞嘧啶碱基编辑器胜出。Liu说，“即使我们把一堆DNA环诱人地打开让它编辑，它也不会编辑”。鉴于YE1的编辑范围比其他的胞嘧啶碱基编辑器小（当停在DNA上时，它只能对三个最近的碱基进行编辑），他和他的团队对它进行改造，使得它具有更大的编辑范围，可对五个最近的碱基进行编辑。结果就是获得一系列更加精确、更具选择性和用途更广泛的碱基编辑器。

更多的停靠点

CRISPR还有另一个要克服的障碍：它访问整个人类基因组的能力有限。Liu说，“实际上，你不能将Cas9停靠在基因组的任何地方。你只能将它停靠在有一小段称为PAM的恒定DNA序列的地方。”

到目前为止，最常见的PAM是NGG，其中“N”是任意一个碱基。但是，两个连续的碱基G仅出现在人类基因组中的大约16个位置上，仅占基因组的6.25％。Liu说：“十六分之一的概率很差。”

为了增加这种概率，Liu和他的实验室让SpCas9变体进行进化，从而能够识别一些仅有一个碱基G的DNA序列，从而让SpCas9变体停靠在基因组中的4个位置上。Liu说，“但是，在SpCas9未涉足的基因组区域中，有一些不含任何碱基G的PAM‘沙漠’。”

这些研究人员利用Liu实验室先前的一项发明，即噬菌体辅助连续进化（phage-assisted continuous evolution, PACE），迫使SpCas9快速进化，从而在大约一周的时间内产生了许多新一代SpCas9变体。若没有PACE，这一过程将花费数月甚至数年的时间。他们的目标是产生具有亲本蛋白所有才能但用途更广泛的新SpCas9变体。只有能够识别不含G的PAM序列的SpCas9变体才能在达尔文选择中幸存下来。