Cell：开发出高效靶向降解流感病毒和SARS

2020年4月22日讯/BIOON/---目前，全球正面临着2019年新型冠状病毒病（COVID-19）的大流行，这种疾病由新型冠状病毒SARS-CoV-2（之前称为2019-nCoV）引起，目前尚无针对它的预防性疫苗或行之有效的药物治疗。据预测，研制出安全有效的预防COVID-19的疫苗将需要12到18个月的时间，届时可能有数百万人受到感染。随着全球范围内的病例和死亡人数迅速增加，面对这种新出现的威胁，人们需要一种灵活而有针对性的保护手段。

由于导致COVID-19、严重急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）的冠状病毒都能够从不同的作为病毒库的动物宿主自发地转移到人类身上，因此迫切需要开发出广泛地抵抗未来可能出现的其他冠状病毒的方法。近期的一份报告指出SARS-CoV-2的两种具有不同基因组序列的毒株（L和S）正在传播，并且可能正在进化，这进一步凸显了开发一种泛冠状病毒靶向策略的必要性。

引起COVID-19的新型冠状病毒SARS-CoV-2属于正义RNA病毒家族，通常通过直接的细胞毒性作用和诱导宿主细胞因子介导的炎症来感染上呼吸道和下呼吸道并导致疾病。SARS-CoV-2的生命周期很可能类似于引起SARS的冠状病毒（SARS-CoV）：病毒进入细胞，将它的RNA基因组释放到细胞质中，并合成负义基因组RNA和亚基因组RNA，接着基于此合成病毒mRNA和新的正义病毒基因组拷贝（图1A）。

虽然大多数正在进行的疫苗通过诱导人类免疫系统识别冠状病毒蛋白或减毒病毒并减少病毒进入细胞来发挥作用，但是，在一项新的研究中，来自美国斯坦福大学等多家研究机构的研究人员提出一种替代性抗病毒方法，它依赖于一种基于CRISPR的系统，用于识别和降解细胞内病毒基因组及其产生的病毒mRNA（图1B）。靶向正义基因组和病毒mRNA以同时降解用于病毒复制和基因表达的病毒基因组模板，这将有望稳健地限制病毒复制。相关研究结果以论文手稿的形式在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Development of CRISPR as an antiviral strategy to combat SARS-CoV-2 and influenza”。

图1.图片来自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.04.020。 为了抑制人细胞中的RNA病毒，这些研究人员使用了源自黄化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）XPD3002的第2类VI-D型CRISPR-Cas13d系统，这种系统是最近发现的由RNA进行引导的RNA内切核酸酶。

Cas13d使用CRISPR相关RNA（crRNA），crRNA含有可定制的长22个核苷酸（nt）间隔序列，从而可以将Cas13d蛋白引导到特定的RNA分子上以便进行靶向RNA降解。Cas13d在人细胞中的高催化活性为靶向SARS-CoV-2以进行特异性病毒RNA基因组降解和病毒基因表达抑制提供了一种潜在的机制。由于Cas13d体积小（967个氨基酸）、特异性高、催化活性强，他们选择了Cas13d而不是其他Cas13蛋白来靶向攻击包括SARS-CoV-2和甲型流感病毒（IAV）在内的RNA病毒。虽然这不是第一项使用Cas13变体来靶向人细胞中病毒序列的研究，但是CRISPR工具是否能被设计成有效靶向和切割SARS-CoV-2序列仍是未知数。此外，他们采用的方法与以往的研究不同，他们的目的是开发出一种同时靶向同一病毒家族中的多种病毒的策略，以便提供广泛的泛冠状病毒保护。

在这项新的研究中，这些研究人员在人细胞中开发出一种预防性抗病毒CRISPR策略（Prophylactic Antiviral CRISPR in huMAN cells，简称PAC-MAN）。作为一种基因干预的形式，PAC-MAN靶向SARS-CoV-2和IAV，并且可能靶向所有冠状病毒。他们构建出一种管道，在许多测序的SARS-CoV-2基因组中确定高度保守的区域，并利用CRISPR-Cas13d靶向这些保守性区域以进行病毒序列降解。

在提交这篇论文手稿时，这些研究人员无法获得活的SARS-CoV-2毒株。因此，他们使用合成的SARS-CoV-2片段，以及在人肺上皮细胞中使用H1N1 IAV毒株进行活细胞感染来测试他们的方法。他们设计并筛选了多个靶向保守性病毒区域的crRNA文库，并确定了最有效的crRNA。

这些研究人员证实这种方法能够切割SARS-CoV-2片段，并减少人肺上皮细胞中的病毒RNA数量。他们的分析揭示出6个crRNA能够靶向91%的已被测序的冠状病毒，以及22个crRNA能够靶向所有已被测序的冠状病毒。通过使用靶向同一病毒的不同区域或者不同冠状病毒毒株的crRNA文库，这种方法可能会对冲病毒进化和逃逸，也可能用来抵御未来出现的相关致病病毒。虽然这一策略在临床上应用之前还有一些障碍需要克服，但PAC-MAN有可能成为一种新的抗病毒策略。